肌母细胞外泌体的制备及其治疗深二度烫伤的实验研究

发布时间：2020-06-01 21:39

【摘要】：深度大面积烧烫伤的临床治疗效果远不能达到患者的期望,留下的瘢痕也给患者带来极大的生理和心理创伤。找到一种更为有效的治疗方法迫在眉睫。外泌体是细胞分泌的直径为30-150 nm的双层膜结构的囊泡,它不仅在细胞通讯和免疫调节中起作用,其组织修复功能近年来也倍受关注。肌母细胞外泌体与干细胞外泌体相比,产量更能满足烧烫伤临床需要并且稳定性更高。本课题以体内外模型为对象,研究了肌母细胞外泌体治疗烫伤的效果及其机制。取得如下主要研究结果:(1)建立了诱导鼠源肌母细胞C2C12分化促进其外泌体分泌的培养条件,并通过超速离心方法分离获得鼠源肌母细胞C2C12外泌体(以下简称C2C12-Ex)。诱导分化条件培养基为:含1%马血清和0.3%胰岛素的高糖DMEM。动态光散射和透射电镜分析所获得的肌母细胞外泌体为圆形或椭圆形并具备双层膜结构,粒径为100nm左右;进一步采用蛋白免疫印迹分析,发现所获得的外泌体中含有大量的外泌体标记蛋白CD63和TSG101;以上结果证明通过超速离心方法成功获得肌母细胞外泌体。并采用BCA蛋白定量方法确定外泌体的产率为2 mg外泌体蛋白/1000 mL条件培养基。(2)建立了体外热激小鼠成纤维细胞损伤模型,发现C2C12-Ex对该模型的细胞有明显的促增殖和抗凋亡效应。分别在40℃、43℃、46℃条件下热水浴刺激小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1和成纤维细胞L929 40 min,在不同时间对细胞计数,结果显示,43℃刺激40 min为最适造模温度;在选定的造模条件下,研究了C2C12-Ex对细胞损伤模型的修复效果,对增殖蛋白PCNA和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达进行分析,结果显示,C2C12-Ex能在该细胞损伤模型中促进PCNA和Bcl-2的表达,表明C2C12-Ex对体外热激受损的成纤维细胞3T3-L1和L929有明显的促增殖和抑凋亡效应。(3)建立了SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型,并研究了C2C12-Ex对该模型的治疗效果及可能机制。烫伤愈合实验发现,C2C12-Ex能显著促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合,且具有剂量效应;对创面组织角质细胞的表面标记CK19、增殖核抗原PCNA和新生血管标记CD31的表达进行分析,发现C2C12-Ex能加速创面更完整地完成表皮再生的过程,并能提前促进细胞和血管大量再生;对各组胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA表达的分析发现,C2C12-Ex在创面愈合过程中,能优化烫伤创面皮肤组织胶原的产生,减少瘢痕的形成。以上研究结果为肌母细胞外泌体C2C12-Ex治疗深Ⅱ度烫伤的临床应用提供了实验依据。
【图文】：

皮肤,表皮,烧烫伤

1 绪论烧烫伤概述1 皮肤的结构与功能皮肤是身体表面包在肌肉外面的组织，是人体最常见也是最大的器官，成展开后面积一般在 1.5 m2-2 m2之间，，占体重的 5%-15%。皮肤分为表皮、下组织三层，表皮由外到内依次为角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层和真皮由纤维、基质及细胞构成，皮下组织由疏松的结缔组织及脂肪小叶组中的附属器官主要为汗腺、皮脂腺、毛囊、血管、和淋巴管等[2]。这些附属调节体温，润滑皮肤，阻止微生物和其他有害物质的入侵。皮肤的总体结.1 所示。

标尺,经典,粒径,形状

1.2 外泌体研究进展1.2.1 外泌体的生物学特性和起源在过去的二十年里，细胞外囊泡被认为是细胞间通讯的重要媒介，它通过在细胞间运输细胞内的活性分子而发挥功能，因此也可以确定这些囊泡参与了诸多生理过程[24]。外泌体属于细胞外囊泡的一个亚群，大多数细胞都会产生外泌体，这种纳米级囊泡具备脂质双层膜，呈圆形或椭圆形的茶托样结构，直径大约在 30-150 nm 之间。尽管在 1983 年就发现了外泌体的存在，但过去一直认为它是细胞废弃物的一种，而最近几年人们发现这种纳米级膜泡中含有来源细胞特异的蛋白、糖、脂质和核酸。细胞通过分泌外泌体来运输外泌体内含有的蛋白、糖、脂质和核酸来介导细胞间的信号传导从而改变其他细胞的功能以及其代谢过程[25]。外泌体的经典形状和粒径如图 1.2 所示[26]。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R644

【参考文献】