脱细胞真皮三维培养高代毛乳头细胞模型的构建及评价

发布时间：2020-06-03 02:00

【摘要】：背景:毛乳头(dermalpapilla,DP)是毛囊底部具有高度特异性的成纤维细胞团,能够分泌多种生长因子,参与调控毛囊的形态发生及生长周期。在体外培养的低代DPC(dermalpapillacell)仍具有诱导毛囊再生的能力。随着体外培养传代次数的增加,DPC逐渐丧失其生物学特性和功能。因此,确保高传代毛乳头细胞在体外培养的条件下仍保持诱导毛囊再生的功能是重建组织工程毛囊的关键。我们认为通过建立新生鼠脱细胞真皮(acellular dermal matrix,ADM)三维培养模型可获得大量有生物学功能的DPC,为重建组织工程毛囊提供充足的种子细胞。目的:(1)构建新生鼠脱细胞真皮三维培养模型(2)对新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行生物特性及功能相关的检测和评价(3)利用新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行体内移植诱导毛囊重建。方法·:(1)构建新生鼠脱细胞真皮三维培养模型采用物理和化学结合的方法将新生鼠真皮进行脱细胞。采用解剖法和胶原酶消化法对成年鼠触须DPC进行分离和培养。在显微镜下观察二维培养和三维培养的毛乳头细胞形态。(2)对新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行生物特性及功能相关的检测和评价生物学特性检测:采用qRT-PCT法检测毛乳头细胞特异性标记物ALP和Versican的基因表达水平;采用免疫荧光法和免疫印迹法检测ALP和Versican蛋白的表达情况。(3)利用新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行体内移植诱导毛囊重建生物学功能检测:利用DPC和新生鼠表皮细胞按照以下分组混合后进行体内移植。移植后2周取材,对移植物进行大体观察和HE染色检测。结果:(1)构建新生鼠脱细胞真皮三维培养模型经过物理结合化学方法脱细胞获得的ADM,经DAPI染色,没有出现细胞核蓝染;经HE染色也不见细胞核蓝染。电镜下观察ADM纤维结构呈网格状排列。(2)对新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行生物特性及功能相关的检测和评价qRT-PCR、免疫荧光染色和免疫印迹检测结果表明:高代DPC在常规二维培养条件下,ALP和Versican表达下调,而高代DPC在ADM上培养后能恢复ALP和Versican的表达。(3)利用新生鼠脱细胞真皮三维培养的毛乳头细胞进行体内移植诱导毛囊重建将2D-P8-DPC与新鲜表皮细胞联合移植未能重建出毛囊。将2D-P3-DPC或者3D-P8-DPC与新鲜表皮细胞联合移植后均能重建出毛囊。结论:(1)通过物理结合化学方法脱细胞可获得ADM,用于培养DPC。(2)通过ADM三维培养的高代DPC可恢复表达细胞内标记物ALP和Versican的表达。(3)通过ADM三维培养的DPCs不仅恢复诱导毛囊再生的能力,可用于体内移植进行毛囊重建。
【图文】：

ＡＤＭ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋（ｒｉｇｈｔ邋ｐａｎｅｌ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋２００逡逑２．邋ＡＤＭ及二维和三维培养后的细胞形态学观察逡逑为了了解ＡＤＭ表面结构，扫面电镜下观察。如图１－２Ａ所示，ＡＤＭ上面逡逑观，可见纵横交错的网格状纤维排列。逡逑为了观察ＤＰＣ在不同培养条件下形态学的改变，首先在低倍镜下观察，可逡逑见二维培养的ＤＰＣ向四周伸展，表面积较大。而三维培养的ＤＰＣ呈长梭形，与逡逑成纤维细胞相似，表面积较二维培养小，细胞聚集生长（图１－２Ｂ）。为了进一步逡逑观察细胞形态，扫描电镜下观察可见二维培养的ＤＰＣ向四周伸出多个触角，细逡逑胞扁平，可见细胞核轮廓，而三维培养的ＤＰＣ形态呈长梭形，细胞聚集生长，逡逑且可观察到细胞堆叠生长的形态（图１－２Ｃ）。逡逑７逡逑

通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测与ＤＰＣ生物学特性相关的细胞标记物ＡＬＰ的ｍＲＮＡ在各逡逑组中的基因表达水平。实验分为３组：二维培养第３代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ３－ＤＰＣ）；二维逡逑培养第８代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）；三雒培养第８代（３Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）。如图２－１所示，逡逑ＡＬＰ在各组之间的表达量存在显著性差异。其中２Ｄ－Ｐ３与２Ｄ－Ｐ８组相比，，差异具逡逑有统计学意义。２Ｄ－Ｐ３与３Ｄ－Ｐ８组相比，差异具有统计意义。逡逑通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测与ＤＰＣ生物学特性相关的细胞标记物Ｖｅｒｓｉｃａｎ的ｍＲＮＡ在逡逑各组中的基因表达水平。如图２－１所示，Ｖｅｒｓｉｃａｎ在各组之间的表达量存在显著逡逑性差异。其中２Ｄ－Ｐ３与２Ｄ－Ｐ８组相比，差异具有统计学意义。２Ｄ－Ｐ３与３Ｄ－Ｐ８组相逡逑比，差异具有统计意义。逡逑５逦ｍ邋２ＤＰ３邋＿邋２ＤＦ８邋□邋／＞ＣＭＰ８逡逑３０００－逡逑＊＊逡逑ｈ＿逡逑｜邋１０００邋ｉｊｉ逦＊逡逑0＿邋一：丨W丁趣逦；：｜：｜：邋丁灥逡逑ｙ邋＾逡逑图２－１二维和三维培养ＤＰＣ的标记物基因表达水平。与ＤＰＣ诱导能力相关的标记物ＡＬＰ和逡逑Ｖｅｒｓｉｃａｎ的基因表达水平。ＡＬＰ和Ｖｅｒｓｉｃａｎ的表达水平在ＡＤＭ－Ｐ８－ＤＰＣＳ组中均较高。阳性对逡逑照：二维培养第３代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ３－ＤＰＣ）；阴性对照：二维培养第８代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）；逡逑实验组：三维培养第８代（３Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）。与２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣＳ相比，＊ｏｒ＊＊ｐ＜０．０５。ｎ＝３。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ邋ｇｅｎｅｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R622

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 南韦肖;张海华;司华哲;李光玉;娄玉杰;;蛋氨酸对水貂毛乳头细胞生长的影响[J];中国兽医杂志;2017年02期

2 李东海;陈罗娣;齐庆;李勇;查旭山;;补发I号方促毛乳头细胞增殖及其分子机制的实验研究[J];中国现代医学杂志;2012年31期

3 李明;薛宏斌;杨喜明;;不同浓度胰岛素对毛乳头细胞的生物学作用的研究[J];中国美容医学;2010年08期

4 张国强;程毅;李玲;高顺强;;胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子7与毛乳头细胞的生长[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年50期

5 王继文;宋志强;陈丽军;邓永键;杨希川;郝飞;;毛乳头细胞分离与培养的改良研究[J];中国麻风皮肤病杂志;2006年01期

6 祁少海;刘坡;谢举临;徐盈斌;盛蹼义;舒斌;利天增;;胎儿毛乳头细胞分化为类成骨细胞的实验研究[J];中华显微外科杂志;2006年01期

7 李宇;李国强;蔡湘娜;林常敏;;微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成[J];中华医学美学美容杂志;2006年06期

8 潘佩英,程波,姜晓勇,何勤,廖跃;层粘连蛋白、纤维粘连蛋白在体外传代的毛乳头细胞中表达的研究[J];贵州医药;2005年10期

9 李宇,林常敏,蔡湘娜,李国强;微囊法体外重建人头皮毛乳头诱导毛囊再生功能的评价[J];中国临床康复;2005年06期

10 蔡湘娜;毛乳头细胞在毛囊生长发育过程中的核心作用[J];中国美容医学;2004年03期

相关会议论文 前10条

1 庄晓晟;范卫新;;适合特殊部位毛乳头细胞的分离培养法[A];中华医学会第十八次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2012年

2 伍津津;;诱导毛乳头细胞凝集性生长的研究[A];中华医学会第十八次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2012年

3 宋志强;郝飞;刁庆春;钟白玉;杨卫兵;麦跃;叶庆佾;;毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因的筛选及分析[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年

4 钟白玉;杨卫兵;杨希川;郝飞;伍津津;;二步酶消化法分离人头皮毛乳头细胞[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年

5 祁少海;刘坡;谢举临;徐盈斌;盛蹼义;舒斌;利天增;;胎儿毛乳头细胞分化为类成骨细胞的实验研究[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

6 李中明;范卫新;;采用体外培养毛乳头细胞诱导毛囊再生的动物模型概况[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年

7 杨希川;;毛乳头在毛发生长、再生中的重要作用（英文）[A];2015全国中西医结合皮肤性病学术年会论文汇编[C];2015年

8 祝康;郑国玺;朱珠;夏翠;;大鼠毛乳头细胞高效分离培养方法及成神经分化潜能探索[A];全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2012年

9 郑敏;吕中法;吴贤杰;;培养毛乳头细胞生物学特性和毛囊重建的研究[A];2006年浙江省整形外科与医学美容学术会议论文汇编[C];2006年

10 王蕾;;防治黑发过早变白——一种新型保健功能的设想[A];膳食变迁对民众健康的影响：挑战与应对——第二届两岸四地营养改善学术会议学术报告及论文摘要汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前9条

1 张献怀;拔胡须 小毛病危害大健康[N];中国医药报;2003年

2 记者 吴仲国;手腕上长出头发来[N];科技日报;2001年

3 蒋晓梅;“吃”出一头秀发[N];经济消息报;2000年

4 浙江省人民医院皮肤科主任医师 潘卫利邋宋黎胜 整理;树叶落了防脱发[N];健康报;2007年

5 山东莱州 郭旭光;青少年白发咋回事[N];上海中医药报;2013年

6 周璇;克隆法治脱发,有点像种高产田[N];新华每日电讯;2008年

7 吕乃群;秃顶——男人的烦恼[N];卫生与生活报;2006年

8 陈晨;美容“他”时代的误区[N];卫生与生活报;2007年

9 徐宝德;男人的胡须不该拔[N];中国中医药报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 肖顺娥;富含血小板血浆对毛乳头细胞生物学的影响及用于毛囊重建的研究[D];南方医科大学;2018年

2 杨希川;毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选[D];第三军医大学;2004年

3 罗洋;人毛乳头细胞生长相关蛋白生物学活性的初步研究[D];第三军医大学;2004年

4 王继文;毛乳头细胞HSPC016基因的全长cDNA克隆及功能分析[D];第三军医大学;2004年

5 杨斌;MRPS17蛋白在人毛囊毛乳头细胞中的表达及其意义[D];第三军医大学;2006年

6 朱兵;内蒙古绒山羊皮肤毛囊毛乳头细胞系的建立及其基因表达谱型的研究[D];内蒙古大学;2014年

7 李美英;大鼠触须毛乳头细胞生物学特性分析及其促脊髓损伤修复潜能研究[D];吉林大学;2014年

8 杨亚东;Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长的作用研究[D];第三军医大学;2008年

9 刘毅;T细胞因子4在毛囊毛乳头细胞中的表达及其功能研究[D];第三军医大学;2008年

10 王欢;天冬氨酸—丝氨酸—丝氨酸重复多肽促进毛发生长作用及其机制研究[D];第三军医大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 周雅婷;绒山羊初级毛囊毛乳头细胞减血清培养条件的建立及BIO对毛乳头细胞诱导能力的影响[D];西北农林科技大学;2018年

2 郭晓东;Dlx3基因在阿尔巴斯绒山羊毛乳头细胞增殖中的调控作用[D];内蒙古大学;2018年

3 刘小敏;脱细胞真皮三维培养高代毛乳头细胞模型的构建及评价[D];南方医科大学;2018年

4 高雯;miR-148a和miR-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究[D];扬州大学;2018年

5 闫玮;Lef1和Msx2基因在阿尔巴斯绒山羊毛乳头细胞增殖中的调控作用[D];内蒙古大学;2017年

6 姜卫;成年鼠背毛毛乳头细胞分离方法的建立与评价[D];南方医科大学;2017年

7 李玲;毛乳头细胞及其部分相关生长因子的研究[D];河北医科大学;2010年

8 倪冬冬;影响毛乳头细胞凝集性生长因素的初步研究[D];第三军医大学;2009年

9 张教扬;体外重建毛乳头的方法探索及其生物学特性的初步实验研究[D];第三军医大学;2007年

10 季煜华;外源性cAMP对小鼠毛囊发育及培养毛乳头细胞的影响[D];西北农林科技大学;2001年

本文编号：2694116