线粒体自噬在压力诱导髓核细胞程序性坏死中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-03 02:55

【摘要】：第一部分压力诱导髓核细胞线粒体自噬及其机制研究目的:观察压力是否导致髓核细胞发生线粒体自噬。方法:取2月龄SD大鼠,水合氯醛麻醉后取腰椎间盘髓核,从中提取髓核细胞,取生长状态良好的第二代髓核细胞在可控气压加压模型装置中加压0 h、12 h、24 h、48h。H2DCFH-DA探针检测线粒体ROS情况,JC-1探针检测线粒体膜电位变化,ATP检测试剂盒检测线粒体ATP变化,NAO染色检测线粒体质量改变,Western blot检测TOM20变化情况,TOM20和LC3B染色激光共聚焦下观察线粒体自噬情况。采用TEM观察压力处理的髓核细胞线粒体自噬变化情况,采用PCR、western blot检测线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin基因及蛋白表达变化,免疫组化结果检测人正常椎间盘和退变椎间盘中PINK1、Parkin变化。结果:压力处理的大鼠髓核细胞出现时间梯度依赖性的线粒体功能紊乱和质量下降。Baf-A1作为一种自噬抑制剂,可阻止压力诱导的线粒体数量减少。TOM20和LC3B共定位显示随着加压时间延长,髓核细胞线粒体和自噬关键蛋白LC3B结合增多。透射电镜下观察可见压力诱导大鼠髓核细胞线粒体被自噬体结构包绕。PCR、western blot结果表示压力可导致髓核细胞线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin基因及蛋白表达增高(P0.05)。免疫组化结果显示人退变椎间盘中PINK1、Parkin表达比正常椎间盘明显增加。结论:压力导致髓核细胞发生PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin在退变椎间盘中高度表达。线粒体自噬可能参与椎间盘退行性变进程。调控线粒体自噬可能为治疗椎间盘退行性变疾病的新靶点。第二部分压力诱导髓核细胞线粒体自噬与程序性坏死关系的实验研究目的:探讨压力诱导髓核细胞线粒体自噬与坏死性凋亡的关系,同时验证压力诱导髓核细胞线粒体自噬的机制。方法:从2月龄大鼠腰段椎间盘内提取髓核细胞培养,取第2代大鼠髓核细胞。使用线粒体自噬抑制剂CsA、Mdivi-1和Parkin Si RNA抑制线粒体自噬后,碘化丙啶(Propidium iodide,PI)流式细胞仪检测细胞坏死率,western blot检测细胞HMGB1释放率,LDH检测试剂盒检测乳酸脱氢酶释放情况。同时,采用线粒体自噬抑制剂CsA抑制线粒体自噬后,检测髓核细胞线粒体功能变化;采用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1抑制线粒体自噬后,western blot检测细胞AIF表达,激光共聚焦检测AIF细胞核表达变化。1 MPa压力条件下培养大鼠髓核细胞0 h、12 h、24 h、48 h,加入荧光探针Fluo-3AM后流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察压力诱导髓核细胞内钙水平变化。使用细胞外钙离子螯合剂EGTA、内质网应激抑制剂Salubrinal、内质网钙通道抑制剂2-APB或dantrolene处理细胞后观察压力条件下细胞钙变化。使用钙抑制剂BAPTA-AM抑制钙水平后western blot观察细胞坏死情况及髓核细胞内线粒体质量和细胞自噬水平的变化情况。同时,为了检测钙介导的线粒体自噬机制,采用western blot方法检测BAPTA-AM对压力诱导下髓核细胞PINK1、Parkin的表达影响。结果:自噬抑制剂和Parkin Si RNA均可显著降低压力诱导的髓核细胞PI摄取率增加,抑制线粒体自噬可抑制细胞释放HMGB1及LDH。CsA可明显改善细胞线粒体功能紊乱发生和活性氧的升高。同时,线粒体自噬抑制剂Mdivi-1显著抑制AIF由线粒体转移至细胞核。1 MPa压力条件下大鼠髓核细胞培养12 h、24 h、48 h,髓核细胞内钙水平与对照组相比均明显增高(P0.05)。内质网应激抑制剂Salubrinal、钙通道抑制剂2-APB可显著抑制压力诱导的髓核细胞钙水平升高。钙抑制剂BAPTA-AM减少髓核细胞坏死率。使用钙抑制剂BAPTA-AM抑制钙水平后髓核细胞线粒体自噬情况明显减少。同时,细胞内线粒体自噬相关蛋白(PINK1,Parkin)表达减少(P0.05)。结论:压力应激条件下线粒体自噬参与压力诱导的髓核细胞程序性坏死。在压力诱导髓核细胞损伤过程中线粒体自噬与程序性坏死是紧密相关的,抑制线粒体自噬可抑制压力诱导的髓核细胞程序性坏死。AIF线粒体至细胞核转移及线粒体功能紊乱参与线粒体自噬介导的髓核细胞程序性坏死。压力导致细胞内质网IP3R钙通道开放,内质网钙释放至胞质。胞质钙参与压力诱导髓核细胞线粒体自噬。钙抑制剂BAPTA-AM可抑制线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin表达水平,从而抑制线粒体自噬,减缓细胞坏死,保护髓核细胞。
【图文】：

可控气压加压细胞培养装置

图 1.2 压力诱导髓核细胞线粒体功能障碍A. NP 细胞受压时间为 0 h、12 h、24 h、4仪测定 ROS 水平。B. 用 MMP 敏感染料 强度与绿色荧光比，从而测定线粒体膜电中 ATP 水平变化的定量分析。 (*P<0.05,*
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王志舒;谭晓荣;刘洹洹;;线粒体自噬调控机制研究进展[J];生物技术通报;2015年06期

2 ;IL-1beta sensitizes rat intervertebral disc cells to Fas ligand mediated apoptosis in vitro[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年10期

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本文编号：2694179