microRNA-29b和金属基质蛋白酶-9在化疗药物治疗骨肉瘤中的作用机制研究

发布时间：2020-06-05 20:12

【摘要】：目的:Micro-RNAs(miRNAs)是一种短链,18-24bp,高度保守的非编码小RNA。据报道,miRNAs在人类癌症患者血清及癌组织中表达异常,与癌症的发生发展密切相关。骨肉瘤细胞中miR-29s的过表达促进细胞凋亡。然而,迄今为止对于miR-29s在人骨肉瘤中的作用尚无充分的研究。MMPs与肿瘤生长和转移密切相关,但MMP-9在人骨肉瘤细胞中的表达和miRNA-29b与MMP-9之间的相互作用,尚未见文献报道。本文主要对骨肉瘤组织中miRNA-29b的表达进行评估,并探讨其对人类骨肉瘤MG-63细胞株的增殖和药物敏感性的作用,探索外源性miR-29b对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的作用和机制,为骨肉瘤的治疗提供新的参考。方法:1.人类骨肉瘤细胞系MG-63购自于ATCC公司,在含10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养,将培养皿置于CO_2为5%,温度为37°C的细胞敷箱中进行培养。将细胞按照1.5×10~5/孔种植在12孔板上,继而用浓度为30 nM miR-29b mimics和阴性对照进行转染。2.从质粒转染后的MG-63细胞中提取总RNA,参照试剂说明书通过三联试剂的进行提纯mRNA。无水RNase被用来溶解总RNA,采用琼脂糖凝胶电泳纯化提取RNA。采用q RT-PCR方法对miR-29b mRNA进行定量分析。由NCBI查询每个mRNA标记的序列,premier 5设计qRT-PCR引物。MMP-9引物序列为:F:5′-ACGCAGACATCGTC ATCCAGT-3′,R:GGACCACAACTCGTCATCGTC;GAPDH引物序列为:F:5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′,R:5′-GGGGTCATTGATG GCAACAATA-3′,依据SYBR Prime Script PLUS RT-PCT试剂盒操作说明书检测每个样品的mRNA相对水平。反应后,将各标志物的mRNA水平进行计算,以GAPDH作为内参。3.组织和细胞样本立即用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液浸泡,然后12000转/分,离心15分钟,收集上层澄清液。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。检测b-actin和MMP-9,用抗人b-actin小鼠单克隆抗体,抗人caspase3小鼠单克隆抗体,抗人pro-caspase3小鼠单克隆抗体,抗人PARP小鼠单克隆抗体抗体,抗人pro-PARP小鼠单克隆抗体,抗人MMP-9小鼠单克隆抗体孵育。检测采用辣根过氧化物酶联抗鼠IgG二抗与皮尔斯?ECL免疫斑点法试剂盒,利用分子成像成像仪CheminDocTMXRS系统检测。4.Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒,检测细胞凋亡。(阿霉素治疗+miRNA转染)处理两天后,MG63细胞收集和磷酸盐(PBS)冲洗,加400ul PBS稀释到浓度为1×10~5细胞/ml,每个培养板加5μl Annexin V-PI和碘化普罗匹定混合,混合彻底治疗细胞被放置在暗室中,进行流式细胞术分析FACScalibur。5.转染后,细胞计数后种植于96孔培养板,密度为5×10~3个细胞/孔,然后利用Kit-8细胞计数试剂盒对细胞分化进行检测,每孔加10μl CCK-8后,将培养板置于37℃温箱孵育1小时,在OD450下测量其浓度值。6.克隆形成实验主要是将MG63细胞1×10~3/孔分三次种植于6孔培养板上,培养两周后用1%细胞结晶紫染色,观察用奥林巴斯SH-50拍照,计数用ImageJ 1.47软件。7.荧光素酶报告:细胞在24孔板中以70-80%的细胞浓度滴加三份,并与Gaussia Luciferase(GLuc)荧光素酶报告质粒和SEAP荧光素酶质粒共转染。在转染48小时后,参照试剂使用说明书,使用一种分泌物-对双荧光测定试剂盒,分析了细胞培养基中GLuc和SEAP的活性。8.统计学分析:所有实验均独立重复检测三次,单因素ANOVA评估数据的显著性,设置p0.05为具有统计学意义。结果:1.人骨肉瘤组织中miR-29b与MMP-9 mRNA的差异性表达首先研究了miRNA-29b水平与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性,miRNA-29b与骨肉瘤转移与临床分期相关,临床I期和II患者miRNA-29b水平比临床III期和有远处转移患者高。我们在人骨肉瘤组织中检测到miR-29b在骨肉瘤中的水平较癌旁低。相反,骨肉瘤组织中MMP-9 mRNA水平远高于癌旁。2.MG-63细胞转染25或50n M miR-29b模拟物和miR-29b对照,24小时后,通过qRT-PCR检测miR-29b与MMP-9的表达量;MG-63细胞在25和50nM miR-29b模拟物转染下,miR-29b表达水平较miR-29b对照组提高了100倍或150倍,而MMP-9 mRNA表达水平较miR-29b对照组降低了40%或50%。利用免疫印迹检测MMP-9蛋白的表达,发现MMP-9表达显著被抑制。转染25和50nM miR-29b模拟物的MG-63细胞,MMP-9的蛋白表达水平分别下调了57%和65%。3.为了明确miR-29b与MMP-9在MG-63细胞中的相互作用机制,我们构建了一种荧光素酶5'UTR野生或突变的MMP-9,野生或突变的5'UTR人MMP-9被插入在一个荧光素酶基因的质粒中。MiR-29b的设计目的位置是5'UTR人MMP-9,转染后,发现伴有25和50nM miR-29b模拟物的存在下,miR-29b转染抑制了荧光素酶40%和60%的活性。然而,miR-29b对突变体5'UTR的荧光素酶MMP-9的表达没有影响。4.为了检测miR-29b对MG-63细胞体外生长的抑制作用,MG-63细胞通过50n M miR-29b模拟物或对照转染,在不同时间点用CCK-8检测细胞的生长。miR-29b模拟物转染的细胞,在所有时间点上的细胞活力均较存活率最低。MG-63细胞滴加到12个孔中(每孔50个细胞)孵育12个小时,然后用50nM的miR-29b模拟物或对照转染。然后观察各组MG-63细胞的菌落形态。经检测发现miR-29b模拟物与miR-29b对照组相比,菌落的大小显著降低。5.使用流式细胞仪检测miR-29b对阿霉素诱导MG-63细胞凋亡的影响。miR-29b转染后,阿霉素诱导MG-63细胞的凋亡率提高了37.5%。用免疫印迹技术对不同组的caspase 3或PARP进行定量分析。MG-63细胞+阿霉素+50nm miR-29b模拟物,caspase 3的表达水平最高,miR-29b转染提高了pro-caspase 3/caspase 3和pro-PARP/PARP的比值分别为40%和27%。结论:1.骨肉瘤组织中miR-29b水平下降,MMP-9水平升高,miR-29b在已转移骨肉瘤和分期较晚的癌组织中高表达,而MMP-9恰好相反。2.miR-29b在骨肉瘤细胞中抑制MMP-9的表达。3.miR-29b具有抑制骨肉瘤细胞分化和促进其凋亡的作用。4.miR-29b/MMP-9可能是参与骨肉瘤发生发展病理过程的重要机制。
【图文】：

骨肉瘤,转染,细胞

对照组骨肉瘤组图 1 骨肉瘤组织及正常对照组织中 miR-29b 的 mRNA 的比较Figure 1 Comparison of mRNA of mir-29b in osteosarcoma tissue and control tissues..2 miR-29b 对人骨肉瘤 MG-63 细胞分化及克隆的影响为了检测 miR-29b 对人骨肉瘤 MG-63 细胞体外生长的抑制作用，人骨肉G-63 细胞通过 50nM 对照或 miR-29b mimics 转染，在不同时间点用 CCK-8 检胞生长。miRNA-29b mimics 转染的细胞在所有时间点上的细胞存活率最低， 4。人骨肉瘤 MG-63 细胞滴加到 12 个孔中(每孔 50 个细胞)孵育 12 个小时，用 50nM 的对照或 miR-29bmimics 进行转染。然后观察各组 MG-63 细胞的生态。经检测发现 miRNA29b mimics 与对照组相比，斑点的大小显著降低，如,3,4。.3 使用 CCK-8 检测 miR-29b 对阿霉素诱导 MG-63 细胞凋亡的影

细胞活力,转染,阿霉素,腺苷二磷酸

斑点的大小显著降低，如图2,3,4。2.3 使用 CCK-8 检测 miR-29b 对阿霉素诱导 MG-63 细胞凋亡的影响miR-29b 转染后人骨肉瘤 MG-63 细胞，阿霉素诱导的凋亡率提高了 37.5%，如图 5,6 所示。用免疫印迹技术对不同组的凋亡相关标志物 caspase 3 (casp3)或多腺苷二磷酸多聚酶抗原进行定量分析。MG-63 细胞+阿霉素+ 50nm miR-29b，caspase 3 的表达水平最高，，miR-29b 转染提高了裂解 caspase 3 和多腺苷二磷酸多聚酶抗原的比值分别为 40%和 27%，如图 7,8。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1

【参考文献】