内源性血管内皮生长因子在皮瓣外科延迟现象中作用的实验研究

发布时间：2020-06-11 03:37

【摘要】：穿支皮瓣移植是修复各种肿瘤(乳腺肿瘤、头颈部肿瘤及黑色素瘤)切除后、外伤、各种慢性病(糖尿病足、褥疮)以及先天畸形所造成的皮肤软组织缺损最为常用的手术方法。尽管随着显微外科技术的发展以及解剖知识的完善,穿支皮瓣移植的坏死率已大大降低,但穿支皮瓣远端的部分坏死仍然是当今整形外科面临的一个重要难题。皮瓣坏死不仅给患者带来了沉重的心理压力,而且增加了住院时间以及经济负担。当前的研究表明不充足的血液供应以及缺血再灌注损伤是穿支皮瓣坏死的主要因素,因此寻求解决这些问题的方法尤为重要。皮瓣的外科延迟是当前研究时间最长,同时也是临床上已经被证实可以有效改善皮瓣存活率的一种方法。虽然其作用机制仍未完全明确,但许多细胞因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)以及胎盘生长因子(Placeta Growth Factor,PIGF)均被证实能有效改善皮瓣的存活能力,其中,以VEGF的作用效果最为明显。VEGF是一种强有力的促血管生成的细胞生长因子,在机体的正常生理和病理条件下均发挥着重要的作用,其效应主要有促进内皮细胞增殖以及血管发生、促进炎症以及增加血管通透性等。目前有关VEGF改善皮瓣存活能力的大部分研究都是通过将外源性的VEGF注射到皮瓣模型中进行研究的,对于皮瓣外科延迟中产生的内源性VEGF的作用目前仍不清楚。阿西替尼(Axitinib)是一种有效的、选择性的抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)酪氨酸激酶的二代抑制剂,能有效抑制内源性VEGF的产生。目前其抑制各种实质性肿瘤的作用已经被证实,但目前还没有在皮瓣中应用的报道。我们选用Axitinib作为皮瓣外科延迟过程中内源性VEGF的抑制剂,通过Axitinib抑制VEGF的表达来探讨内源性VEGF在皮瓣外科延迟中的生物学作用。本研究将从以下三个部分进行阐述。第一部分:大鼠多血管体穿支皮瓣模型的构建本部分研究中,我们首先在体外观察大鼠皮瓣模型构建完成后大鼠的生活习性及皮瓣状况,这是本研究的基础。结果发现外科延迟6天组,大鼠皮瓣颜色正常,质地软,毛细血管反应实验好,而对照组及延迟3天组大鼠皮瓣均有不同程度的坏死。进一步我们通过使用红外热成像仪成像观察皮瓣外科延迟后相邻两个血管间微小血管的吻合(choke vessels)区的血管变化,结果发现外科延迟6天组,大鼠的胸背动脉和肋间后动脉(the thoracodorsal artery and posterior intercostal artery,TD-PIC)choke vessels区与肋间后动脉和旋骼深动脉(posterior intercostal artery and the deep circumflex iliac artery,PIC-DCI)choke vessels区的白色热点均有明显增加,表明外科延迟可将choke vessels区的血管转化为直接连接。为证实外科延迟能有效改善皮瓣的存活能力,我们在预实验中观察外科延迟后皮瓣的存活面积,结果发现,对照组皮瓣坏死面积较大而外科延迟6天组皮瓣的存活面积显著高于对照组。综上,本研究结果显示,外科延迟能通过改变choke vessels区的血管状况进而改善皮瓣的存活能力,另外,在本实验中使用的皮瓣模型最佳延迟时间可能是6天。由于皮瓣choke vessels区血管的变化可能与内源性VEGF的生成有关,因此在本研究的第二部分我们将对外科延迟过程中产生的内源性VEGF进行抑制,并对抑制的有效性以及抑制率进行研究分析。第二部分:Axitinib在皮瓣外科延迟中对VEGF抑制有效性的研究在本部分研究中,我们首先对Axitinib抑制VEGF的最佳剂量进行了测定。研究发现Axitinib注射剂量为10mg/kg,2次/天时,可以达到最佳的抑制效果。我们进一步通过western blot分别检测外科延迟后以及Axitinib抑制外科延迟后皮瓣choke vessels区的VEGF及其信号分子的表达情况。结果显示外科延迟3天,VEGF的表达量最大;而Axitinib抑制后,VEGF的表达量显著下降。我们进一步研究了磷酸化的血管内皮生长因子受体(phosphorylated-vascular endothelial growth factor receptor,p-VEGFR)的表达情况,结果显示外科延迟3天,p-VEGFR的表达量最大;而Axitinib抑制后,皮瓣中的p-VEGFR的表达也显著下降。上述结果表明Axitinib能通过抑制p-VEGFR的表达进而抑制内源性VEGF的产生。为进一步证实我们抑制的有效性,我们对VEGF细胞内的下游信号通路进行分析。Western blot结果显示皮瓣外科延迟能激活VEGF介导的Akt-mTOR-HIF-1α信号通路、PI3K-Akt的细胞增殖通路以及eNOS/Akt信号通路,而经Axitinib抑制后这些信号通路则被明显抑制。进一步我们使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测Axitinib抑制内源性VEGF的抑制率,结果显示,抑制第6天,抑制率高达91.6%。综上,本部分的研究结果显示,Axitinib抑制VEGF的最佳剂量是10mg/kg。外科延迟能有效增加皮瓣中内源性VEGF的表达并活化其下游信号传导通路。而Axitinib能通过抑制VEGFR的磷酸化进而抑制内源性VEGF的产生,并且由VEGF介导的Akt-mTOR-HIF-1α信号通路、PI3K-Akt的细胞增殖、凋亡通路以及eNOS/Akt信号通路也被有效抑制了。VEGF的抑制率91.6%表明Axitinib抑制的有效性。在下一部分研究中我们将观察并探讨Axitinib抑制外科延迟中产生的内源性VEGF后,皮瓣choke vessels区的血管在分子水平的变化,进而证实内源性VEGF在皮瓣外科延迟中的作用。第三部分:内源性VEGF在皮瓣外科延迟中作用的研究在前两部分研究中,我们观察并探讨了本实验大鼠皮瓣模型的最佳延迟时间以及Axitinib抑制VEGF的最佳抑制时间以及抑制的有效性。在本部分研究中,我们首先从分子水平探讨内源性VEGF在皮瓣外科延迟的作用。结果显示:内源性VEGF具有能改善皮瓣外科延迟中choke vessels区血管舒张的作用。虽然外科延迟3天时已经出现choke vessels区的血管舒张,但在外科延迟6天时该效应达到最大。我们使用anti-CD31抗体检测choke vessels区的微血管密度,结果显示内源性VEGF也具有能改善皮瓣外科延迟中choke vessels区微血管生成的作用。但这种作用在外科延迟3天时不明显,在外科延迟6天时效应达到最大。进一步我们将延迟组及抑制组的皮瓣存活面积进行比较发现:外科延迟6天组的皮瓣存活面积显著高于抑制6天组,外科延迟6天时,皮瓣的存活面积高达94.6%;另外,抑制组6天组的皮瓣存活面积显著低于对照组。这表明内源性VEGF能有效改善外科延迟后皮瓣的存活能力。综上,本部分研究显示在皮瓣外科延迟过程中,内源性的VEGF既具有促进choke vessels区血管舒张的作用也具有促进choke vessels区血管生成的作用,并且能有效改善皮瓣的存活能力。
【图文】：

亚型,结构示意图,受体结合

6图 2.1 VEGF 亚型结构示意图[49]Fig 2.1 Schematic diagram of VEGF subtypesVEGF 需要与相应的受体结合才能发挥生物学活性。目前已知的血管内皮生长因子受体有 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 及两个辅助受体神经毡蛋白Neuropilin-1(Nrp1)和 Neuropilin-2(Nrp2)[45, 50, 51]。所有受体均为酪氨酸激酶受体超家族膜蛋白，其特征为均有胞外区、跨膜区和胞内区。不同的 VEGF 亚型能选择性的与特异性的受体结合，VEGF-A能与VEGFR-1和 VEGFR-2结合，VEGF-B和 PIGF 只能与 VEGFR-1 结合，，VEGF-C 和 VEGF-D 均能与 VEGFR-2 和VEGFR-3 结合，而 VEGF-E 只能与 VEGFR-2 结合[52]。不同的 VEGFR 受体分布

示意图,亚型,示意图,血管内皮细胞

第 2 章综述位置也不同。VEGFR-1 和 VEGFR-2 主要分布在血管内皮细胞中，与内皮细胞的增殖、血管生成以及毛细血管的通透性有密切关系[53-55]。另外，VEGFR-1 在滋养层细胞、单核细胞以及肾小球系膜细胞中也有表达，VEGFR-2 也存在于造血干血胞、巨核细胞以及视网膜祖细胞中，而 VEGFR-3 主要存在于静脉和淋巴管内皮细胞中，其作用主要是调控生长发育及淋巴内皮细胞的生长，Nrp1 和 Nrp2主要分布在血管内皮细胞和神经轴突中，其作用的发挥需要依赖于 VEGFR-2，单独无明显作用[50]。（图 2.2）
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R622

【相似文献】