酸敏感离子通道1a偶联内质网应激在大鼠椎间盘髓核退变中的作用机制研究

发布时间：2020-06-14 21:23

【摘要】：第一部分内质网应激及ASICla在大鼠椎间盘髓核中的表达目的:探索大鼠椎间盘髓核组织中内质网应激和ASICla的表达及其与退变的关系。方法:获取大鼠4周、8周、12周、24周、40周、60周共6个时间点大鼠脊柱正中冠状面切片。HE染色观察细胞成分及形态演变,阿利辛蓝、天狼星红染色观察软骨基质与纤维基质表达变化,马松染色观察肌纤维与胶原纤维表达变化。免疫组织化学染色观察ASICla、GRP78、XBP1、eIF2a、CHOP和Caspase12表达分布。8周SD大鼠穿刺诱导椎间盘退变,术后8周行MRI观察造模情况,Western blot、qRT-PCR比较正常及退变椎间盘髓核中ASICla、GRP78、XBP1、CHOP和Caspase12的表达情况。结果:自然退变过程中,随年龄增长,椎间盘髓核中细胞数目逐渐减少,胶原纤维和蛋白多糖含量逐渐降低。自然退变过程中,内质网应激代表性指标GRP78、XBP1、p-eIF2a、CHOP和Caspase12在椎间盘髓核中均有表达。其中GRP78、XBP1和p-eIF2a在年轻椎间盘中表达较高,随退变进展表达逐渐降低。CHOP和Caspase12表达在年轻椎间盘表达较低,退变后表达较高,但严重退变后表达再次降低。ASICla表达在40周前呈现逐渐上升趋势,60周时表达明显下降。穿刺诱导退变的大鼠椎间盘髓核中,GRP78、XBP1和p-eIF2a表达降低,CHOP和ASICla表达增加,Capsase12表达无明显变化。结论:1.内质网应激参与了大鼠椎间盘髓核退变过程,包括UPR反应相关指标和促凋亡通路指标在椎间盘髓核中均有表达,其中UPR的表达和髓核功能相关。2.ASICla在大鼠椎间盘髓核中表达,退变过程中ASICla的表达逐渐增加,严重退变的髓核组织中ASICla表达降低。第二部分酸诱导的大鼠NPCs损伤与内质网应激目的:体外模拟椎间盘酸性环境,检测酸刺激对NPCs的影响,探索酸性环境中内质网应激活化及功能。方法:不同pH值培养不同时间,模拟椎间盘酸性微环境,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型。CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。Western blot检测衰老、自噬、凋亡蛋白表达情况。内质网应激特异性阻断剂4-PBA用于阻断内质网应激。透射电镜观察内质网结构变化。采用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法检测内质网应激的表达活化。结果:急性酸刺激激活内质网应激,并诱导髓核细胞自噬、老化和凋亡。轻微酸刺激(pH7.0)时,髓核细胞增殖速度加快,而衰老和凋亡相关指标无明显变化,持续延长的酸刺激能降低NPCs活力和增殖能力,并诱导NPCs衰老、凋亡。在pH7.4时,NPCs中内质网应激相关指标表达较低,轻微酸刺激(pH7.0)即可激活内质网应激和UPR反应,严重酸刺激(pH6.5)活化内质网应激中促凋亡通路。4-PBA能够降低酸活化的内质网应激,降低自噬并显著加剧酸诱导的细胞凋亡和G1期停滞(p0.05)。结论:NPCs具有一定的酸抗性。急性酸刺激能够诱导内质网应激,内质网应激在急性酸刺激中主要起抗凋亡和衰老的保护性作用,是髓核细胞酸抗性的重要组成部分,严重酸刺激能够导致内质网应激特异性凋亡。第三部分ASICla的活化与内质网应激的偶联关系目的:检测酸刺激下NPCs中ASICla的表达和激活,探索ASICla的激活与内质网应激的偶联关系。方法:模拟椎间盘的酸性环境,采用Western blot、免疫荧光检测ASICla在正常大鼠椎间盘髓核细胞中的表达情况。构建siRNA干扰ASICla的NPCs。采用Fura-2/AM荧光探针检测ASICla在酸性环境中的活化,CCK8法、Ki67免疫荧光染色评价ASICla活化对NPCs活力和增殖的影响,流式细胞术检测ASICla活化对NPCs凋亡的影响,qPCR、Western blot检测内质网应激的表达变化情况。结果:(1)正常NPCs中少量表达ASICla,酸刺激能够诱导ASICla表达上调,在一定时间范围内,ASICla的表达随酸度增加、刺激时间延长而增加。酸度过大或酸处理时间过长,均会导致ASICla表达下降。(2)在pH 7.4时,细胞内Ca2+浓度处于一个稳定的较低的基线值,pH6.5的酸性溶液刺激能够活化NPCs表面的ASICla,使细胞膜对Ca2+通透性显著上升,导致Ca2+内流明显增加。在不含Ca2+的培养体系或阻断ASICla后均可以降低Ca2+内流。(3)CCK8、Ki67及流式细胞术结果提示酸刺激能够降低NPCs活力和增殖能力,诱导髓核细胞凋亡。阻断ASICla能够降低酸诱导的髓核细胞凋亡,4-PBA能够使之反转。(5)4-PBA能够明显降低酸诱导的内质网应激蛋白标志物表达,包括GRP78、CHOP和Caspasel2,并降低eIF2 a的磷酸化水平和XBP1的剪切修饰。阻断ASICla能够降低酸诱导上升的GRP78、CHOP和Caspase12在mRNA和蛋白水平的表达,部分降低eIF2a的磷酸化水平,对XBP1的剪切无明显影响。结论:酸刺激能够诱导ASICla的表达及活化,激活后的ASCIla能引起细胞膜对Ca2+通透性大幅增加,导致细胞钙超载而损伤。阻断ASICla能够显著增加酸刺激下NPCs存活率和增殖活力,部分降低酸诱导的内质网应激活化,对UPR影响较小,提示ASICla是良好的治疗靶点。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.53
【图文】：

时髓核细胞数目达到顶峰，髓核区域内含有大量的胶原纤维和蛋白多糖成分。４０周逡逑时，髓核细胞数目明显下降，６０周时髓核组织形态不清晰，髓核细胞数目大幅降低，逡逑细胞多数聚集成团，胶原纤维和蛋白多糖成分含量明显降低。（图１－２，邋１－３，邋１－４）逡逑３５逡逑

示随年龄增长，ＡＳＩＣｌａ的表达存在先升高后下降的趋势。４周－８周时，ＡＳＩＣｌａ表达率逡逑较低，１２－２４周时ＡＳＩＣｌａ表达增高，以４０周为代表的中年鼠椎间盘中ＡＳＩＣｌａ达到表达逡逑高峰，６０周时出现明显下降。（图１－５，＊ｐ＜０．邋０５，＃ｐ＜０．邋０１）逡逑３７逡逑

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本文编号：2713379