MG53蛋白联合hUC-MSCs移植对创伤性脑损伤小鼠的治疗作用

发布时间：2020-06-22 15:10

【摘要】：创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是一种常见的由于外力引起脑部神经功能障碍和神经细胞死亡的损伤性疾病,能够导致严重的生理、心理以及认知功能方面障碍。为了有效治疗TBI,迫切需要一种新型的治疗方法。干细胞与再生医学的出现为TBI治疗提供新的思路。研究发现,干细胞移植可以通过旁分泌和细胞替代途径对TBI发挥保护作用。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有更新速度快、低免疫原性和畸胎瘤形成风险低等特点,具有潜在的应用价值。TBI损伤之后由于组织缺血和炎症反应会导致产生大量的活性氧,引起组织病理和细胞死亡,阻碍移植后细胞的迁移和存活。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein,MG53)是TRIM(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白成员之一,也是细胞膜修复中的重要组成部分。在啮齿类动物和大多数动物模型中,MG53蛋白可以保护多种细胞膜免受破坏,同时也能改善肌营养不良、急性肺损伤、心肌梗死和急性肾脏损伤等疾病,而且静脉注射MG53蛋白能够透过血脑屏障,从而保护脑缺血性损伤。然而,目前有关重组人MG53蛋白联合hUC-MSCs治疗TBI的研究尚未见报道。此外,MG53蛋白能否单独对损伤的神经元细胞发挥保护作用也未见报道。目的本课题旨在探究MG53蛋白对神经元细胞的保护作用以及其联合hUC-MSCs对TBI小鼠的保护作用。建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型,研究MG53蛋白对HT22增殖、凋亡、周期、迁移、抗氧化的影响及其分子机制。以TBI小鼠为研究对象,探讨MG53蛋白联合hUC-MSCs移植对TBI小鼠的治疗作用和分子机制。方法第一部分研究MG53蛋白对LPS诱导的HT22细胞损伤的保护作用1、CCK-8法检测细胞增殖,筛选LPS作用于HT22细胞的最佳浓度及时间。实验分为正常对照组(Normal Control,NC组)、MG53组、LPS组和MG53+LPS组。2、采用流式细胞术检测MG53蛋白对HT22细胞周期与凋亡的影响。3、划痕实验检测MG53蛋白对HT22细胞迁移的影响;ELISA检测细胞SOD活力和MDA含量变化。4、qRT-PCR检测MG53蛋白对HT22细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达的影响。5、Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、细胞周期蛋白(Cyclin D1)及TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白等的表达变化。第二部分探讨MG53蛋白联合hUC-MSCs治疗TBI的作用及机制1、C57BL/6小鼠建立TBI模型,随机分为TBI组、MG53组、MSCs组和MG53+MSCs组。2、术后3天,PI染色检测损伤部位皮质区细胞死亡情况,干湿重法检测脑水肿情况。3、Western Blot检测小鼠病灶部位MG53蛋白、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax以及促生存通路相关蛋白p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表达变化。4、免疫荧光检测海马区MAB1281表达情况,ELISA试剂盒检测小鼠血清中SOD活力和MDA含量。5、术后1-28天,mNSS评估小鼠神经功能恢复情况、Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力;术后28天,新事物识别实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验检测小鼠的抑郁程度。6、CV染色检测小鼠脑损伤体积,qRT-PCR检测BDNF、NGF的表达;术后14天、28天,免疫荧光检测海马区DCX、NeuN表达情况。结果第一部分MG53蛋白对LPS诱导的HT22细胞损伤的保护作用及其机制初步研究1、CCK8结果显示,LPS诱导对HT22细胞增殖具有浓度和时间依赖双向效应,即低浓度水平促进细胞增殖,高浓度水平抑制细胞增殖,引起细胞凋亡(P0.05),其中500mg/L LPS作用HT22细胞48 h后,细胞抑制率接近50%,用于后续实验模型的建立。2、与LPS组相比,MG53+LPS组细胞存活率升高,凋亡率降低,G_0/G_1期减少,S期增加,迁移能力增加(P0.05)。Western Blot结果显示,与LPS组相比,MG53+LPS组细胞中Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,Cyclin D1表达升高(P0.05)。3、ELISA结果显示,与NC组相比,LPS组细胞SOD活性降低,MDA含量升高,与LPS组相比,MG53+LPS组细胞的SOD活性升高,MDA含量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。4、Western Blot结果显示,与NC组相比,LPS组TNF-α,IL-6和IL-1β蛋白表达上调(P0.05),TLR4/NF-κB信号通路中总的NF-κB p65蛋白表达无显著变化(P0.05),IKBα蛋白表达水平降低(P0.05),TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表达升高(P0.05);与LPS组相比,LPS+MG53组TNF-α,IL-6,IL-1β蛋白表达水平降低(P0.05),总的NF-κB p65表达无显著变化(P0.05),IKBα表达升高,TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表达降低(P0.05),qRT-PCR的结果与Western Blot的结果一致(P0.05)。第二部分MG53蛋白联合hUC-MSCs治疗小鼠创伤性脑损伤1、术后3天,与TBI组相比,各治疗组小鼠的大脑病灶侧含水量明显降低,联合治疗组小鼠脑含水量最低(P0.05),病灶对侧脑含水量无显著差异(P0.05);与TBI组相比,各治疗组小鼠的大脑皮质PI阳性细胞减少,抑凋亡蛋白Bcl-2表达升高,促凋亡蛋白Bax表达降低,而联合治疗组变化最明显(P0.05)。2、免疫荧光结果显示,MSCs组和MG53+MSCs组能够检测到MAB1281阳性细胞,TBI组和MG53组未检测到MAB1281阳性细胞;与TBI组相比,各治疗组小鼠血清中自由基清除剂SOD活力升高,氧化应激产物MDA含量降低,且联合治疗组的效果更明显(P0.05)。3、Western结果显示,MG53组和MG53+MSCs组能够检测到MG53蛋白,而TBI组和MSCs组未检测到MG53蛋白;与TBI组相比,MG53组p-Akt1和p-ERK1/2的表达显著升高(P0.05),p-GSK3β无显著变化(P0.05),MSCs组和MG53+MSCs组的p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表达均显著升高(P0.05),而且联合治疗组变化更明显(P0.05),但是总的Akt1,GSK3β和ERK1/2的表达没有显著变化(P0.05),提示MG53蛋白和hUC-MSCs可能是通过调控PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信号通路对脑损伤小鼠起保护作用。4、术后各组小鼠体重在1天、3天减轻,从7天开始增加。术后7天后,与TBI组相比,各治疗组小鼠体重明显增加,mNSS评分明显降低,且联合治疗组小鼠体重增加最快,mNSS评分最低(P0.05);与TBI组相比,各治疗组小鼠穿越平台次数增加,平台所在象限停留时间增加,逃避潜伏期时间缩短,悬浮时间减少,辨别指数和糖水偏好度均显著提高(P0.05),且联合治疗组的效果更明显(P0.05)。5、与TBI组相比,各治疗组小鼠神经营养因子BDNF、NGF mRNA表达升高(P0.05),且联合治疗组表达最高(P0.05);免疫荧光结果显示,与TBI组相比,各治疗组小鼠海马区DCX和NeuN阳性细胞增加(P0.05),联合治疗组阳性细胞数增加更显著(P0.05)。结论1、MG53蛋白能够促使LPS损伤的HT22细胞存活,抑制细胞凋亡,促使细胞从G0/G1期向S期运转,提高细胞迁移力和抗氧化能力,抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低LPS诱导的炎症反应。2、MG53蛋白和hUC-MSCs能够透过血脑屏障迁移到TBI小鼠损伤部位,治疗后能够增加小鼠体重,改善认知功能,增强学习记忆能力,提高神经恢复,减轻抑郁,抑制细胞凋亡,促进神经再生,提高抗氧化水平,而且联合治疗比单一治疗效果更加明显。此外,MG53蛋白和hUC-MSCs可能通过激活PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信号通路对TBI小鼠发挥保护作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.15
【图文】：

不同浓度LPS处理的HT22A：正常培养48h的HT22(200×)，B：500mg/L的LPS处理48h的HT22(200×)，C：

MG53蛋白联合hUC-MSCs移植对创伤性脑损伤小鼠的治疗作用

MG53对LPS损伤的HT22细胞存活率的影响

【参考文献】