缺氧诱导因子-1α在创伤性颅脑损伤后血管再生过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-11 13:50

【摘要】：创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后血管损伤是TBI关键的原发事件,可引起一系列继发损伤,是TBI修复的关键环节。成功的血管再生为神经元再生和重塑提供关键的神经血管微环境,此过程中其产生的有效灌注可以清除损伤因子,促进神经修复和生长因子的转运,为神经元和突触的再生提供营养,有利于神经功能的恢复。因此,近年来TBI治疗的促血管生成策略越来越受到人们的关注。缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一种转录调节因子,可调控血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(i NOS)等靶基因的转录,是低氧条件时血管系统应答的调节中心。相关研究证实,HIF-1α在大鼠缺血性心肌损伤和脑损伤模型中可以诱导新生血管的形成,然而HIF-1α在TBI后的表达情况及其在血管再生中的作用机制尚不明确,本研究旨在探讨HIF-1α在大鼠TBI模型中的表达情况及血管再生过程中的作用和机制。第一部分大鼠颅脑损伤后缺氧诱导因子-1α的表达规律及其表达机制目的观察大鼠颅脑损伤后缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的动态表达规律,并探讨其可能的表达机制。方法将56只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=8只)、假手术组(n=8只)、创伤性颅脑损伤组(TBI组,n=40只),通过改良Feeney法建立颅脑损伤(TBI)模型,TBI组按从受伤到处死时间的长短分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d和TBI-14d共5个亚组,每个亚组8只大鼠,用正常大鼠作为Sham组,假手术组仅切开皮肤及打开骨窗,保证硬膜完整,不进行打击损伤。利用逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术及Western blot技术检测模型建立后HIF-1αm RNA、蛋白质及上游调控因子脯氨酸羟化酶区域蛋白2(Prolyl Hydroxylase Domain Protein 2,PHD2)的表达情况;采用HE染色观察TBI模型建立后病灶的病理变化,采用免疫组织化学方法(SP法)检测挫伤灶及周围脑组织中HIF-1α蛋白的表达情况,应用显微图像分析系统计算阳性细胞数目。结果(1)RT-PCR对照组、假手术组以及TBI组SD大鼠脑组织中均检测到HIF-1αm RNA的表达,三组表达无明显差异(p0.05);与对照组相比,TBI-24h、3d HIF-1αm RNA表达明显增高(P0.01),TBI-6h、7d、14d无明显差异(p0.05);(2)Western blot对照组、假手术组未检测到HIF-1α蛋白的表达。PHD2蛋白于sham组及假手术组正常表达,于TBI组中明显降解,三组表达差异明显(P0.05);(3)免疫组化对照组、假手术组未检测到HIF-1α蛋白表达,颅脑损伤后挫伤灶及周围脑组织HIF-1α表达增加,阳性表达主要位于神经元细胞胞核内;TBI组各亚组于TBI-6h开始表达,于TBI-3d到达表达高峰,TBI-7d开始下降,至TBI-14d恢复至损伤前水平;结论颅脑损伤后各种病理过程导致脑组织缺血缺氧,诱导缺氧诱导因子-1α表达增加,其表达调控机制为转录后调控,PHD2蛋白的降解使HIF-1α的表达增加。第二部分2-ME-2对大鼠颅脑损伤缺氧诱导因子-1α及其下游血管再生相关因子表达的影响目的通过检测予以二甲基雌氧二醇(2-methoxyestradiol,2-ME-2)干预后大鼠损伤灶及周围脑组织中HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9和CD31表达的变化,探讨HIF-1α在TBI后大鼠血管新生中可能起到的作用。方法成年健康SD大鼠80只,随机分为TBI组和TBI+2-ME-2组,每组40只,两组均参照改良Feeney自由落体法制作大鼠颅脑损伤模型。根据伤后处死时间分别将两组随机分6h、24h、3d、7d和14d共5个亚组,每亚组各8只。TBI+2-ME-2-6h、24h亚组于模型制作成功后即刻腹腔注射2-ME-2(2.5mg/kg)一次,3d、7d和14d亚组于伤后注射一次,连续于伤后2天各注射一次,TBI组于同一时间点腹腔注射等量DMSO。每亚组随机取四只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过Western blot技术检测HIF-1α在两组不同时间点的表达情况;通过RT-PCR技术检测HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9的表达情况;剩余的4只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化,采用免疫组织化学方法(SP法)检测挫伤灶及周围脑组织中CD31蛋白的表达情况,应用显微图像分析系统计阳性细胞的数目。结果(1)Western blot大鼠TBI模型制作成功后6h HIF-1α蛋白表达开始增加,24h到3d内达到高峰,14d恢复至损伤前水平;使用HIF-1α阻滞剂2-ME-2干预后HIF-1α在各个时间点的表达较损伤组均明显下降(p0.01,有显著统计学意义);(2)RT-PCR①损伤组和抑制剂组HIF-1αm RNA表达水平没有明显改变(p0.05);②VEGF在损伤组6h表达增加,7d和14d高表达,使用2-ME-2干预后VEGF m RNA水平较损伤组明显降低(p0.05,有显著统计学意义);③Ang-1 m RNA的表达水平:损伤组Ang-1m RNA在TBI后早期表达不明显,7d、14d表达明显增加,说明Ang-1参与新生血管的成熟调控,使用2-ME-2干预后Ang-1 m RNA水平较损伤组表达明显降低(p0.01,有显著统计学意义);④TBI组MMP-9 m RNA的表达水平:MMP-9在损伤组6h表达增加,24h达高峰,并处于高峰状态达3d,7d表达开始下降,14d表达较前明显降低,2-ME-2干预后MMP-9m RNA水平在TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d上表达较损伤组明显降低(**p0.01、*p0.05,有显著统计学意义);(3)免疫组化TBI组SD大鼠脑组织CD31的表达,在TBI-6 h、24h、3d表达不明显,TBI-7d、TBI-14d表达明显增加,TBI-2-ME-2组TBI-7d、TBI-14d挫伤灶及周围脑组织CD31蛋白表达较TBI组均明显下降(P0.05)。结论创伤性颅脑损伤后HIF-1α表达增加,诱导血管再生相关基因VEGF、Ang-1的表达,促进损伤血管的修复和再生。然而HIF-1α也可以促进MMP-9的表达加重脑水肿的程度。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15
【图文】：

血管形成,概略图,骨髓

　Ｍ?1：HIF-1α在血管形成过程中可能起到的作用概略图1、HIF-1 因子和内皮祖细胞(Endothelial Precursor Cells, EPCs)在成年哺乳动物，内皮祖细胞多存在于骨髓，妊娠妇女的脐带血，羊水和胚胎中，在理化因素刺激下，可以从骨髓动员并迁徙到外周循环血中，进而归巢到损伤组织参与损伤器官血管的修复，这为血管损伤相关性疾病的研究治疗提供了新的思路。EPCs 跟成骨细胞、造血干细胞等一起位于骨髓提供的微环境里，在受到缺血缺氧刺激时增殖增加，并动员进入外周血，最终募集、归巢进入损伤组织[12]；EPO 是一类由成人肾间质成纤维细胞和胚胎造血细胞合成分泌的细胞生长调控因子被释放入血后能进入骨髓进而调控红细胞的生成抑制造血祖细胞的凋亡。低氧刺激 HIF-1α表达上调后与 EPO 编码基因低氧结合区域结合后激活 EPO 表达进而产生促进红细胞生成的作用[13]。此外，最近的研究部分也证实了 HIF-1α-SDF-1/CXCR 通路在 EPCs

骨蜡,磨钻,手术器械,自由落体

图 1：A 动物手术台、实验用手术器械、骨蜡、剪刀、“T”形撞垫(上端直径为 5mm 的圆形，下端为 3×3×2.5mm 的立方柱)等辅助器械；B 实验用高速显微磨钻；C 自制自由落体装置及自制撞垫(导管长度 30cm，可根据打击程度调节导管高度)超低温冰箱(LEGACI，美国)；电动玻璃匀浆机(DY-891，宁波新芝)；移液器枪一套(Eppendorf Reference，1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl)；分光光度计(UV-2000，美国 UNICO)；高速冷冻离心机(KDC-210HR)；基因扩增仪(GeneAmp PCR System9700)；电泳仪；量筒、烧杯、三角烧瓶等。电子分析天平(BS224S，德国赛多利斯)；病理组织漂烘仪(PHY-Ⅲ，常州中威)；石蜡切片机(Leica，德国)；光学显微镜(Zeiss Axio Scope. A1，德国蔡司)；电热恒温培养箱(HG303-4K，南京)。1.2 主要试剂总mRNA提取用Trizol试剂由美国Invitrogen公司购得；100次cDNA逆转录试剂盒

头皮,骨膜

缺氧诱导因子-1α在创伤性颅脑损伤后血管再生过程中的作用及机制研究第一部分2、手术刀片切开皮肤，长约 3cm，取右侧颅顶旁正中切口，利用眼科组织剪游离软组织、剥离骨膜，暴露 0.5cm2大小的颅骨，定位于前囟后 1.5mm、矢状缝右侧2.5mm 为中心。3、利用显微手术用电动磨钻进行颅骨开窗，利用蚊式钳将骨窗扩大至 5mm×5mm的正方形骨窗(注意：操作过程中要保持硬脑膜完整)。4、解开大鼠固定的四肢，使其俯卧于动物台上，取自制“T”形撞垫(下端为3×3×2.5mm 的立方柱，上端直径为 5mm 的圆形，下端立方柱可自由进出骨窗)下端置入已打开骨窗。5、将大鼠头左偏，以保证“T”形撞垫平面与动物台平行，将导引管中心正对“T”形撞垫中心安放自由落体打击导引管，25g 砝码沿高 30cm 的自由落体导引管落下，直接撞击撞垫进行一次打击(撞击能量为 750g cm)，造成局灶性颅脑损伤。6、模型制作成功后，使用医用双氧水、碘伏反复冲洗伤口，无菌医用骨蜡封闭

【参考文献】