低强度脉冲超声优化BMSCs移植修复脊髓损伤的实验研究

发布时间：2020-07-22 04:13

【摘要】：【目的】脊髓损伤(spinal cord injuries,SCI)是骨科一种严重的创伤性疾病,其发病率高,致残率高,目前尚无有效治愈的方法。本课题组前期研究发现骨髓间充质干细胞(BMSCs)可促进脊髓损伤的修复,但体外培养的BMSCs细胞生物活性较低,对BMSCs进行优化以提高移植效果是研究的热点。本研究旨在通过利用自主搭建的低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)干预系统,输出不同强度超声以激励BMSCs,观察细胞形态变化,检测BMSCs增殖活性改变,得到LIPUS最佳干预优化条件,获得优化LIPUS-BMSCs种子细胞;检测LIPUS干预后BMSCs细胞凋亡以及神经营养因子(Neurotrophic factors,NTFs)表达的改变,以研究LIPUS对BMSCs的激励作用。移植优化的LIPUS-BMSCs修复大鼠脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI),评价细胞移植后大鼠的后肢运动功能、组织形态结构和损伤局部NTFs的表达,探讨LIPUS促进BMSCs细胞移植修复SCI的机制。【方法】1.体外实验BMSCs的提取和培养:从Wistar大鼠获取BMSCs,全骨髓贴壁筛选法纯化细胞,并进行体外培养、扩增。通过流式细胞技术检测CD29、CD90、CD34、CD45鉴定BMSCs。LIPUS超声设备建立:自主搭建LIPUS细胞干预系统,包括电源,信号发生器、信号放大器和超声换能器,以超声示波器检测超声波形和超声强度。设定不同LIPUS干预强度激励BMSCs,光镜下观察细胞状态。通过检测不同强度LIPUS干预下体外培养的BMSCs增殖活性的改变,确定最佳LIPUS干预条件。BMSCs细胞生物活性的检测:TUNEL法检测超声干预后BMSCs的细胞凋亡状态。蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)法检测NTFs表达量的变化。2.体内实验动物模型建立和分组:36只Wistar大鼠随机分为假手术组、对照组、BMSCs移植组和LIPUS-BMSCs移植组,采用脊髓挫伤模型。大鼠SCI后7天,分别对BMSCs移植组、LIPUS-BMSCs移植组大鼠进行BMSCs和LIPUS-BMSCs细胞移植。对照组大鼠注射DMEM/F12,假手术组大鼠脊髓暴露后不进行脊髓挫伤,且不进行细胞移植或培养液注射。细胞移植效果评价:通过BBB量表评价假手术组、对照组、BMSCs移植组和LIPUS-BMSCs移植组大鼠的后肢运动功能。各组取脊髓组织做HE染色、免疫荧光、ELISA,检测脊髓组织结构改变和损伤脊髓中心NTFs的表达。【结果】1.LIPUS超声干预系统:本研究成功搭建LIPUS超声干预系统,可体外优化BMSCs。检测BMSCs增殖活性改变,确定LIPUS最佳干预强度为50mW/cm~2。2.细胞生物学活性:提取原代BMSCs细胞状态良好,细胞鉴定证实第三代BMSCs纯度在95%以上。LIPUS干预可提高BMSCs的增殖活性,而细胞凋亡率差异无统计学意义。LIPUS干预后NTFs合成增加,其中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)的表达明显增加,差异具有统计学意义。3.行为学评估:细胞移植后21天,BMSCs移植组、LIPUS-BMSCs移植组BBB评分高于对照组,差异有统计学意义。细胞移植后28天,BMSCs移植组和LIPUS-BMSCs移植组之间BBB评分差异有统计学意义,LIPUS-BMSCs更好的促进了大鼠后肢运动功能的恢复。4.组织学观察:细胞移植后,尤其是LIPUS-BMSCs移植组,脊髓空洞减小,脊髓灰质内组织结构有所恢复,神经纤维存活增加,轴突增生活跃,反应性胶质细胞增生减少。ELISA检测证实LIPUS-BMSCs细胞移植后,脊髓局部BDNF、NGF表达水平提高,其效果优于BMSCs移植组,差异有统计学意义。【结论】本研究体外实验表明,利用自主搭建的LIPUS超声干预系统激励BMSCs可以提高细胞增殖活性,增加NTFs表达,为细胞移植修复SCI提供了大量优化的LIPUS-BMSCs种子细胞。BMSCs移植后,大鼠的运动功能得到了改善,损伤脊髓局部组织结构有所恢复,NTFs表达提高,促进了损伤脊髓的修复。同时,LIPUS-BMSCs的效果明显优于BMSCs。实验证明LIPUS作为一种体外激励方法可以在一定程度上提高BMSCs在SCI修复中的作用,且具有无创、安全的优点,为SCI修复的细胞移植的种子细胞优化提供了新的手段。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2
【图文】：

大鼠BMSCs

BMSCs细胞鉴定

LIPUS超声干预示意图及设备图

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本文编号：2765312