雌激素对脂肪移植炎症调控及脂肪存活的影响

发布时间：2020-07-26 08:56

【摘要】：背景和目的由于先天性畸形导致外观上的不对称,外伤或是手术后的软组织缺损或容量减少的现象一直是修复重建外科学中所面临的重大挑战。脂肪移植作为自体来源的移植物,其获取较容易、操作简单,因富含成人干细胞,脂肪不仅有填充作用,还可以改善缺血组织的存活与再生,近年来逐渐成为一种重要的软组织修复工具。尽管脂肪移植后效果显著长期观察移植后的脂肪移植物可能出现高吸收率,甚至是油囊、纤维化等并发症。近年有学者在临床研究中提出妇女的年龄(大于或小于45岁)是脂肪抽吸物中脂肪细胞存活的差异点;在动物模型中,降低雌激素可干扰脂肪移植物保留。目前,雌激素水平对于脂肪移植的保留率影响仍不明确。因此,我们分别模拟绝经前期(CON组,正常雌激素)、绝经期(OVX组,低雌激素)及孕期(HE组,高雌激素)来探讨雌激素对脂肪移植物的存活的影响及免疫调控机制。方法1.不同雌激素浓度动物模型构建评价及对脂肪移植物保留率的影响分别通过卵巢摘除(OVX组)、假手术(CON组)与皮下埋入17β-雌二醇药片埋入(HE组),调控小鼠的雌激素水平45天,后行ELISA检测小鼠血清雌激素水平;此时同时进行同体积自体脂肪移植手术,在移植后不同时间点取材称重,进行苏木精-伊红染色(HE)、免疫荧光观察脂肪组织形态及组织学的结构改变;RT-PCR进行移植物中雌激素受体α(ERα)的表达量。2.雌激素在脂肪移植中对炎症细胞的募集调控、脂肪再生及组织中血管形成的影响从移植区取下的脂肪移植物进行胶原酶消化处理,提取SVF细胞进行流式细胞检测中性粒细胞的含量、巨噬细胞进行亚型分类(促炎巨噬细胞Ml型及抗炎巨噬细胞M2型)的表达百分比、RT-PCR检测相应巨噬细胞分泌的炎症因子(TNF-α及IL-10)及脂肪组织中非血源性干细胞的含量进行评估;基因芯片用于评估移植后一周的脂肪组织,并分析纤维化基因表达;组织免疫荧光及RT-PCR对血管化、干细胞增殖、分化能力进行评估。结果1.不同雌激素浓度动物模型构建评价及对脂肪移植物保留率的影响(1)雌激素表达水平与移植前脂肪组织体积呈反比ELISA检测小鼠血清雌激素浓度证实造模成功。HE组ERα表达量(3.07±1.1 pg/ml)为最高,而OXV组最低(3.07±l.lpg/ml)。造模45天后,低雌激素的小鼠脂肪垫重量要比其余两组重2倍以上。(2)低水平雌激素可促进早期脂肪再生、肥大及雌激素受体的高表达脂肪移植后在第十二周,OVX组保留率最高。HE、免疫荧光结果显示:低雌激素组比正常雌激素及高雌激素组,在移植后第一周,可见大量脂肪组织被破坏并出现明显脂滴聚集,到第二周时就开始有丰富的多房脂肪细胞浸润。十二周时,OVX组的脂肪细胞直径明显大于CON及HE组。ERα检测发现OVX组早期表达是下降的,但第四周时表达升高到第十二周时为表达的高峰。2.雌激素在脂肪移植中对炎症细胞的调控、脂肪再生及血管化的影响(1)高雌激素生理环境可导致炎症细胞浸润不足及M1往M2巨噬细胞转换的异常在脂肪移植后急性炎症反应中,OVX组CDllb+粒细胞(中性粒细胞与单核巨噬细胞表面抗原)的浸润最为强烈。这个现象与我们发现OVX组中早期细胞被炎症破坏,油滴释出,进而油囊产生的组织学表现相符合。第二周可见到OVX及CON两组巨噬细胞表型开始从M1往M2巨噬细胞转换,然而HE组早期Ml型局势细胞浸润缺乏,而第二周开始出现延迟的Ml浸润。结果提示HE组在早期促炎巨噬细胞浸润不足,从而导致早期坏死脂肪的破坏减弱及后期清除坏死组织的不足。(2)低雌激素在脂肪移植物纤维化的评估虽然在马松染色中未见因强烈炎症导致包膜的增厚,但在基因芯片的微点阵图中显示:脂肪移植早期在OVX组就可有脂肪组织纤维化基因表达的倾向。因此,可解释在OVX组中脂肪纤维化的标志物胶原蛋白VI(COL-6)表达的增加。(3)在雌激素调控模型中早期血管生成水平与脂肪移植后的保留率不同步我们发现只有在正常雌激素浓度时移植物的血管化是最好。HE组在早期最高的血管化水平,但伴随着脂肪组织的延迟坏死VEGF的表达量也随之下降。然而,OVX组的早期血管化虽稍弱,但由于其充分的坏死吞噬与促炎信号提供与转归,为脂肪再生与肥大提供了适宜的微环境,最终获得最高的保留率。(4)高雌激素对组织局部干细胞具有保护作用,但却抑制了其脂肪细胞增殖、分化能力在实验中观察到HE组拥有大量的局部干细胞的表达,Ki67+表达量从第四周到第十二周呈现明显增加的趋势,但是PPAR-γ在第十二周时表达最低,因此我们认为HE组的脂肪分化与脂质沉积受到抑制。结论1.通过卵巢摘除、植入雌激素药片处理后,成功构建模拟雌激素生理浓度的动物模型。2.卵巢摘除组中因低雌激素环境导致移植初期血管化无优势,但除了诱导脂肪细胞肥大之外,在卵巢摘除组移植早期大量募集中性粒细胞及M1巨噬细胞,及时浸润清除坏死脂肪组织,为后期脂肪再生提供空间条件。3.在孕期高雌激素环境中,脂肪有较高含量的干细胞,并易于早期建立/保留血管化成分。但由于雌激素对干扰急性炎症反应及成脂的抑制作用,移植物的保留率低且出现中心坏死,提示高剂量的激素替代治疗可能干扰脂肪移植的术后的保留率。此实验为构建的理想化模型,忽略小鼠年龄、性别差异及其他可能的荷尔蒙水平因素的干扰,然而通过分析在不同雌激素环境中脂肪移植物的存活机制,我们为临床研究提供更多的线索与更深入的理论依据。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R622
【图文】：

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同组的单侧腹股沟脂肪垫的重量测量显示ＯＶＸ脂肪重量较重（０．１９±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑并且明显重于ＨＥ组（０．０７±０．０２ｇ，ｎ＝４）邋（Ｐ＜０．０５）及ＣＯＮ组（０．１１±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑（Ｐ邋＜０．０５），而ＨＥ组则为三组中重量最轻的脂肪组织（见图１－１Ｂ）。在进行卵巢逡逑摘除及植入雌激素药片４５天后，利用ＲＴ－ＰＣＲ检测各组移植前腹股沟脂肪垫中雌逡逑激素受体ａ邋（ＥＲａ）量，ＯＶＸ组的表达量（０．４５士０．２）低于ＨＥ组（３．０７±ｌ．ｌ）（ｐ＜０．０５），逡逑结果显示ＥＲａ的表达量与体循环雌激素的浓度成正比。逡逑Ａ逦Ｄ逦ＩＮＧＵＩＮＡＬ邋ＦＡＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑Ａ．逦Ｂ．逡逑＊逡逑０．２５－１逦＿逦＊逦＊逦■逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ逦0２0＿邋丁逡逑１０＇１５＊邋ｖ逡逑０．０５－逡逑Ｉｎｇｕｉｎａｌ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ（ｌ邋ｍｏｎｔｈｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｐｙａｒｊｅｃｔｐｍｙ，逡逑ｅｓｔｒｏｇｅｎ邋ｉｍｐｌａｎｔ邋ｏｒ邋ｓｈａｍ邋）逦0邋Ｉ逦

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Ａ），并且重量的保留率最好为５２％（０．００３±０．００１５％），而ＣＯＮ组移植物为逡逑肉粉色并且质地细软，其保留率则为２８％（０．００１６±０．０００５％），保留率最低的ＨＥ逡逑组为２２％邋（０．０００９５±０．０００５％）（户＜０．０５）（见图１－３，邋Ｂ）。这些移植物的重量不受逡逑到小鼠本身体重的影响。因此，我们实验结果认为雌激素在自体脂肪移植中扮演逡逑者重要的角色。逡逑Ａ．逦Ｂ．逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ逡逑１Ｗ逦一逦ＦＡＴ邋ＧＲＡＦＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑＾邋Ｏ．ＯＯ８－１逦＊逡逑ｒ，团网逦ｉ逦－ｃ0Ｎ逡逑２ｗＵＩＩ！ＩＲｙｉ逦ｆ＿．ｈｅ逡逑ＤＱＥ９逦Ｉ。－逡逑ＣＯ邋0邋００２－逡逑６邋０．０００－１邋￣Ｉ逦１逦１逦１逦１—逡逑Ｕ逦１Ｗ邋２Ｗ邋４Ｗ邋８Ｗ邋１２Ｗ逡逑图１－３腹股沟脂肪垫移植于小鼠头皮下。可见ＯＶＸ组在第１２周时体积最大，呈黄白逡逑色并且触感坚韧富有弹性，ＣＯＮ组则呈现条状质地柔软的脂肪组织，ＨＥ组移植物重量逡逑最轻并且呈小而软的脂肪组织（Ａ）。各组在不同时间点脂肪移植相对于体重的相对重逡逑量保留率（＊为邋ＯＶＸｖｓ．邋ＨＥ邋组；？＜０．０５）（＃为邋ＣＯＮｖｓ．ＨＥ邋组尸＜０．０５）邋（Ｂ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｃａｌｐ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ．邋Ａｔ邋ｗｅｅｋ邋１２，邋ｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＯＶＸ邋ｇｒｏｕｐ邋ｌｏｏｋｅｄ邋ｙｅｌｌｏｗ邋ａｎｄ邋ｆｅｌｔ邋ｆｉｒｍ邋ａｎｄ邋ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ．邋Ｈｏｗｅｖｅｒ

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