miRNA-122在猪DCD供肝质量评估中的作用研究

发布时间：2020-08-06 11:55

【摘要】：前言肝脏移植是治疗终末期肝病最有效的手段,但供肝来源短缺与等待肝脏移植患者数量之间的矛盾仍是目前全球器官移植面对的难题,国外20世纪60年代开始利用心脏循环死亡后器官捐献(Donation after Cardio-circulatory Death,DCD)供体,之后被脑死亡后器官捐献(Donation after Brain Death,DBD)供体所取代,直到20世纪80年代,欧美移植中心重新关注DCD供体。与DBD供体相比,DCD供肝术后发生移植物原发性无功能(primary non-function,PNF)、肝动脉血栓形成(hepatic artery thrombosis,HAT)等严重并发症机会明显增加,这与在心脏停跳过程中发生复杂缺血、缺氧条件所导致的热损伤明显相关。因此对于DCD供肝的质量评估显的尤为重要,以避免放弃可用供肝造成的器官浪费,以及应用不适合供肝造成严重不良后果。目前对DCD供肝质量评估方式主要有冷-热缺血时间、脂肪肝程度、供者血钠水平、年龄、肝炎感染、肿瘤等方面,仍没有一种客观反映供肝损伤程度及预测预后的指标,因此,寻找一种敏感、客观的评估指标是目前DCD肝脏移植面临的一个严峻问题。miRNA-122是miRNA家族的一员,约占肝脏细胞中总miRNA的70%,且在其他组织中检测不到,胚胎时期,肝脏细胞中miRNA-122水平开始升高,在成年鼠肝脏中,每个细胞中含量可达到66000拷贝,人的肝细胞中可达到135000拷贝,miRNA-122序列从人到斑马鱼都是高度保守的,而且斑马鱼的原位杂交也说明miRNA-122肝脏特异性也是高度保守的。miRNA-122参与肝脏的发育分化、基因表达调控和功能代谢,研究表明其与非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝细胞癌、药物性肝损伤均有明显相关性,近年来随着对miRNA-122研究的深入,在肝移植方面,Verhoeven等的研究报告显示,DCD供肝低温机械灌注期间,灌注液中miRNA-122水平对供肝缺血损伤有一定评估作用,也有实验表明,术后受者血清中miRNA-122水平可早期预测术后急性排斥反应及缺血性胆道并发症,但在DCD供肝获取过程中,供肝组织中miRNA-122水平与供肝损伤程度及对移植后肝脏功能恢复预测方面的研究鲜有报道。目的:本实验通过建立猪DCD肝脏移植模型,研究DCD供肝组织中miRNA-122表达水平变化与供肝损伤程度及术后肝功能恢复情况的相关性,同时进一步建立合并低氧血症的DCD肝脏移植模型,研究热缺血合并缺氧对供肝损伤的影响,以及供肝组织中miRNA-122表达水平对热缺血合并缺氧所致供肝损伤的评估作用,为DCD供肝损伤评估提供新的监测指标及对以后供肝保护提供新的干预靶点。方法:1、通过“窒息”方法模拟临床Maastricht III型DCD肝移植过程,建立猪DCD肝脏移植模型,在不同热缺血时间点(缺血0分钟、10分钟、20分钟、30分钟)留取新鲜肝脏组织及病理制片所需肝脏组织。2、建立合并低氧血症的猪DCD肝脏移植模型,在不同缺氧处理时间点(缺氧15分钟、30分钟、60分钟)及缺氧合并热缺血时间点(缺氧15分钟、30分钟、60分钟合并热缺血20分钟)留取新鲜肝脏组织及病理制片所需肝脏组织。3、提取肝脏组织中总miRNA,采用qRT-PCR方法测定不同时间点肝脏组织中miRNA-122表达水平,监测肝脏移植后不同时间点(移植术后1小时、3小时、6小时、12小时、24小时)血清酶学变化及总胆汁量情况。4、以多样本方差分析方法比较各监测指标随肝脏缺氧及热缺血时间变化有无统计学差异,以柱状图表示各监测指标随时间变化趋势。结果:1、在猪DCD肝移植模型中,热缺血10分钟时,供肝组织病理学并没有明显改变,但供肝组织中miRNA-122表达水平已先于供肝组织病理改变出现异常升高。2、随着热缺血时间延长,供肝病组织病理学开始出现改变,组织中miRNA-122表达水平也有逐渐升高趋势,供肝组织中miRNA-122表达水平在不同缺血时间组之间有统计学差异(p0.05),移植术后不同时间点肝功能指标在各组间有统计学差异(p0.05)。3、单纯缺氧处理15分钟、30分钟、60分钟对供肝组织病理基本无影响,但供肝组织中miRNA-122表达水平在缺氧处理60分钟时开始明显升高,且与缺氧处理15分钟及30分钟组有统计学差异(p0.05)。4、在不同缺氧合并缺血处理组,供肝组织中miRNA-122表达水平随缺氧处理时间延长有升高趋势,组间有统计学差异(p0.05),移植术后不同时间点肝功能指标在各组间有统计学差异(p0.05)。结论:1、“窒息”法建立猪DCD移植模型具有相对安全、可控性强等优点,可以很好地模拟临床Maastricht III型DCD肝脏移植过程。2、供肝组织中miRNA-122表达水平在热缺血10分钟时开始升高,先于供肝组织病理改变,且随缺血时间延长继续升高,miRNA-122水平可以反映供肝热缺血损伤情况,同时供肝组织中miRNA-122水平与术后肝功能指标变化有一定相关性,可以作为供肝热缺血损伤的一个评估指标。3、供肝组织中miRNA-122表达水平在缺氧处理60分钟时明显升高,供肝组织中miRNA-122水平可以反映缺氧对供肝的损伤,可以作为供肝缺氧血损伤的一个评估指标。4、供肝组织中miRNA-122水平对供肝缺氧合并热缺血损伤有良好的评估作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.3
【图文】：

过程图,过程图,热缺血时间,实验动物

C D图 1 猪肝移植过程图A、肝脏低温保存及修整；B、肝上下腔静脉吻合；C、门静脉吻合完毕；D、肝下下腔静脉完毕，各吻合口不狭窄、不漏血。2.2.2 实验动物分组DCD 实验动物共 18 头，随机分为 3 组，热缺血时间分别为 10 分钟、20 分钟30 分钟。2.2.3 标本留取及指标测定（1）开腹后留取肝脏组织，作为对照，不同热缺血时间组留取对应时间点（缺血10分钟、20分钟、30分钟）肝脏组织，留取肝脏移植后1小时、3小时、6小时12小时、24小时肝脏组织标本、血清标本及术后24小时总胆汁量。

热缺血时间,病理学,HE染色,水肿

C D图 2 不同热缺血时间肝脏组织病理学 HE 染色（×200）A 正常肝脏 B 热缺血 10min C 热缺血 20min D 热缺血 30min3.1.2 移植后肝脏病理学改变热缺血 20 分钟组，移植后 1 小时，肝细胞形态发生改变，主要表现在部分胞出现水肿，个别细胞有坏死现象；随着术后时间延长，肝细胞水肿明显加重胞核开始碎裂，移植后 24h 时，明显出现细胞碎裂，细胞坏死。见图 3

组织病理学,HE染色,热缺血时间,表达水平

11E图 3 移植后肝脏组织病理学 HE 染色（×200）A 移植后 1h B 移植后 3h C 移植后 6h D 移植后 12h E 移植后 24h3.2 不同热缺血时间组供肝组织中 miRNA-122 表达水平qRT-PCR 半定量分析，肝脏组织中 miRNA-122 相对表达水平在热缺血 10 分时已有升高，且随着热缺血时间延长，表达量有逐渐升高趋势，各组之间均有统学差异。见图 4

【参考文献】