miRNA-21-5p在诱导缺氧环境中成骨细胞分化凋亡关系的分子机制研究

发布时间：2020-08-06 14:11

【摘要】：目的通过将miRNA-21-5p转染到成骨细胞MV3T3-E1中,检测不同转染浓度及转染时间转染成骨细胞后miRNA-21-5p含量的变化,同时检测转染后成骨细胞分化蛋白:骨钙蛋白、P1NP和RUNX2含量的变化;同时检测不同时间和转染浓度转染成骨细胞MV3T3-E1后成骨细胞外基质矿化程度,从而揭示miRNA-21-5p与成骨细胞分化和矿化的相关性,为临床治疗骨折不愈合、骨质疏松药物的研究和开发提供新的作用靶点,具有重要的价值。方法成骨细胞来源于ATCC(洛克威乐,马里兰州,美国),使用15%血清的DMEN培养基,培养于37℃、CO2恒温孵育箱中培养、传代。采用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,内参为U6。使用Lipofectamine 2000转染miR-21-5p mimics,将miR-21-5p基因编码序列克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体上,使用双荧光素酶基因报告实验验证miR-21-5p的靶点。mimics转染细胞24h后进行ECM矿化试验。使用分光光度计测定450 nm处溶液的光密度值。使用碱性磷酸酶二乙醇胺活性试剂盒检测碱性磷酸酶的相对活性。采用Western blot法测定SMAD7蛋白水平表达。结果RT-PCR结果显示转染miR-21-5p mimics能提高miR-21-5p体外水平。30 nM miR-21-5p mimics转染0、1、3、6、12或24小时后,miR-21-5p相对水平随着时间的延长,含量逐渐升高。与对照组比较,miR-21-5p mimics转染细胞12小时后,骨钙素、P1NP和RUNX2的mRNA水平显著升高(p0.05)。miR-21-5p与成骨细胞标记物(骨钙素、P1NP、RUNX2)水平呈正相关。细胞外基质矿化实验显示,30或60 nM的miR-21-5p mimics转染细胞12小时后,其矿化节点的形成显著上调,矿化点的OD 450值增加。miR-21-5p mimics转染的MC3T3-E1细胞中,细胞成骨早期的标志物碱性磷酸酶活性显著增高。双荧光素酶基因报告实验显示:转染3'UTR、miR-21-5p mimics(30nM或60nM)与pLuc-SMAD7 3’UTR与对照(30nM或60nM)相比,其双荧光素酶相对活性存在显著的降低了。然而,pLuc-SMAD7 3'UTR与miR-21-5p mimics转染的MC3T3-E1细胞中,30 nM和60 nM组相对荧光素酶活性差异无统计学意义。此结果表明,miR-21-5p mimics通过靶向SMAD7的3'UTR降低了MC3T3-E1细胞相对荧光素酶活性,即miR-21-5p靶向SMAD7的3'UTR。进一步Western blot显示,转染组细胞中SMAD7的表达水平显著低于对照组细胞。结论1.miR-21-5p促进成骨细胞成骨分化标志物(骨钙蛋白和P1NP,RUNX2,碱性磷酸酶)的生成,促进成骨细胞分化。2.miR-21-5p通过靶向SMAD7的3'UTR端发挥促进成骨细胞分化的作用。3.miR-21-5p可能是促进成骨细胞分化、抑制骨质疏松和促进骨折愈合的重要调控分子。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R683;R580
【图文】：

成骨细胞原代培养Figure1Primarycultureofosteoblasts

24图 1.2 miRNA-21-5p 不同转染浓度转染成骨细胞后其 miRNA-21-5p 表达的变化Figure 1.2 Changes of miRNA-21-5p expression in osteoblasts after transfecting with differenconcentrations of miRNA-21-5p

图 1.3 30nM miRNA-21-5p 转染成骨细胞不同时间点检测其 miRNA-21-5p 的差异经比较转染 3 h 后显著增加,而且水平稳定在直到 24 hFigure 1.3 The difference of miRNA-21-5p in 30nM miRNA-21-5p transfected osteoblasts atdifferent time points increased significantly after transfection at 3 hours, and the level wasstable until 24 hours

【参考文献】

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本文编号：2782514