瘫痪脊髓提取液对新生大鼠脑神经干细胞增殖影响的体外实验研究

发布时间：2020-08-10 09:32

【摘要】：目的:探讨不同时间点的瘫痪大鼠脊髓提取液对新生大鼠脑神经干细胞(NSC)增殖分化的影响。方法:(1)新生大鼠脑神经干细胞的取材、分离、培养、鉴定、传代培养至第五代,备用。[18,19,20]。(2)将15只健康的雌性成年SD大鼠分成三组,每组5只:瘫痪组用WD法制作T9平面完全性截瘫的SD大鼠脊髓损伤模型,假手术组在相同节段仅做椎板开窗,正常组不做处理,造模8、24、72h,5、7、14 d后制备各组脊髓提取液。(3)将传至第5代的新生鼠脑神经干细胞分为9个组培养:A组-空白对照组(即培养基中加入PBS液共同培养),B组-正常组(即培养基中加入正常脊髓提取液共同培养),C组-假手术组(即培养基中加入假手术脊髓提取液共同培养),D组-瘫痪1组(即培养基中加入8h瘫痪脊髓提取液共同培养),E组-瘫痪2组(即培养基中加入24h瘫痪脊髓提取液共同培养),F组-瘫痪3组(即培养基中加入72h瘫痪脊髓提取液共同培养),G组-瘫痪4组(即培养基中加入5d瘫痪脊髓提取液共同培养),H组-瘫痪5组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养),I组-瘫痪6组(即培养基中加入14d瘫痪脊髓提取液共同培养)。(4)共同培养1、2、3、4、5 d,用噻唑蓝(MTT)比色法检测每个高倍镜下NSC的数目来反映不同瘫痪脊髓提取液对NSC增殖能力的影响;共同培养24、48h,提取细胞总RNA,逆转录-多聚酶联反应(RT-PCR)检测Notch1、Hes1的表达。结果:(1)新生SD大鼠(2-3 d内)脑源性细胞在体外可以大量扩增、形成球状团聚物,而且可以连续的、稳定的传代,培养到第5代的细胞Nestin免疫荧光染色(+)[7]。(2)培养后1d各组神经干细胞的MTT值,A组为0.1317±0.0250,B组为0.1424±0.0331,C组为0.1487±0.0303,D组为0.1939±0.1613,E组为0.1839±0.1513,F组为0.887±0.115,G组为0.937±0.145,H组为0.2139±0.1733,I组为0.1899±0.1589;其中H组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05);第2 d各组MTT值:A组为0.1860±0.0187,B组为0.1813±0.0324,C组为0.1955±0.0311,D组为1.213±0.025,E组为1.287±0.031,F组为0.2287±0.0313,G组为1.403±0.025,H组为0.2864±0.0253,I组为1.313±0.025,H组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05);第3 d各组MTT值:A组为0.2378±0.0288,B组为0.2452±0.0310,C组为0.2276±0.0273,D组为0.2911±0.3306,E组为0.2951±0.3106,F组为0.2851±0.3106,G组为0.3116±0.3376,H组为0.3217±0.3276,I组为0.2811±0.2913,H组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05);第4 d各组MTT值:A组为0.2865±0.0238,B组为0.2806±0.0337,C组为0.3070±0.0197,D组为0.3533±0.0274,E组为0.3733±0.0284,F组为0.3633±0.0287,G组为0.3733±0.0268,H组为0.3812±0.0297,I组为0.3511±0.0274,H组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05);第5 d各组MTT值:A组为0.3224±0.0175,B组为0.3094±0.0273,C组为0.3149±0.0173,D组为0.3831±0.0166,E组为0.3931±0.0216,F组为0.3911±0.0197,G组为0.4331±0.0182,H组为0.4376±0.0232,I组为0.3831±0.0147,H组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05)。A、B、C组之间每个高倍镜下在各时间点的细胞MTT值没有明显差异(P0.05)。各个瘫痪组的MTT值均显著高于A、B、C组(P0.05),其中瘫痪组中瘫痪5组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)各时间段点细胞MTT值显著增高,高于其他8组(P0.05)。(3)各组24h Notch1m RNA的表达:A组为1.003±0.099,B组为1.175±0.162,C组为1.076±0.212,D组为1.312±0.333,E组为1.879±0.148,F组为2.325±0.427,G组为2.712±0.183,H组为3.800±0.495,I组为3.107±0.278;各组48h Notch1m RNA的表达A组为1.003±0.099,B组为1.203±0.170,C组为1.063±0.067,D组为1.629±0.249,E组为2.108±0.136,F组为3.035±0.128,G组为4.132±0.574,H组为7.217±0.279,I组为4.191±0.291。各组24h Hes1m RNA的表达A组为1.016±0.212,B组为1.146±0.213,C组为1.156±0.352,D组为1.540±0.386,E组为1.875±0.084,F组为2.207±0.199,G组为3.960±0.569,H组为4.659±0.422,I组为3.602±0.495;各组48h Hes1 m RNA的表达情况:A组为1.010±0.176,B组为1.177±0.119,C组为1.282±0.462,D组为2.213±0.756,E组为2.735±0.599,F组为3.725±0.294,G组为5.302±1.192,H组为7.675±0.838,I组为6,302±0.637,整个瘫痪组24h和48h的Notch1、Hes1 m RNA的表达比A、B、C三组强(P0.05),而A、B、C组24h和48h的Notch1、Hes1 m RNA的表达基本没有明显的差异(P0.05)。在瘫痪组中,H组-瘫痪5组(即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养)在各个时间点的Notch1、Hes1 m RNA的表达明显高于其他8组(P0.05)。结论:(1)新生SD大鼠脑神经干细胞不仅具有扩增、分化成多类神经细胞的能力,表达原始神经细胞的表面标记物Nestin,符合NSC的判定。(2)瘫痪脊髓提取液可以上调神经干细胞Notch1和Hes1 m RNA的表达水平、促进NSC的增殖,可模拟SCI后的微环境。(3)SCI后,7d的脊髓提取液促进大鼠脑NSC的增殖以及Notch1和Hes1 m RNA的作用最强,且随共培养的时间增加而增加,因此推测在脊髓损伤的第7d封闭Notch信号可能是促进内源性NSC增殖的最佳时机。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2
【图文】：

原代培养,新生大鼠,神经干细胞,相差显微镜

图 1. 新生大鼠神经干细胞一般生长情况(倒置相差显微镜)A：原代培养第 24 小时（100×）B：原代培养第 3 天（100×）C：原代培养第 5 天（×100）D：原代培养第 8 天（E：传至第 5 代培养第F ：诱导分化后第 5 Figure1. General character of newborn rat , s NSC （ invcontrast microscope）A: primary culture 24 hours(×100)B: primary culture 3 days (×100)C: primary culture 5 days (×100)E: to fifth generatiodays (×200)F: 5days after di(×200

细胞分布,免疫荧光染色,红色荧光,白质

图 2: nestin 免疫荧光染色（红色荧光×13.2. 大鼠脊髓组织 HE 染色正常脊髓: 正常的脊髓，可见组织白质分界清楚，灰质细胞分布均匀白质内神经纤维沿脊髓纵轴方向排损伤后 8 小时: 灰白质内神经元细区分，可见有少许红细胞渗出.(图损伤后 24 小时:脊髓组织结构紊乱红细胞浸润，神经元数目减少、残损伤后 72 小时: 灰、白质分界不

病理,损伤后,坏死组织,细胞碎片

西南医科大损伤后 7 天: 水肿和出血得到改善减少，出现坏死组织细胞碎片，灰域可见胶质细胞增生，毛细血管形损伤后 14 天: 脊髓组织排列疏松洞及胶质瘢痕形成. (图 4G)

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