晚期糖基化终末产物对人软骨细胞增殖和自噬影响的研究

发布时间：2020-08-15 00:36

【摘要】：目的:研究晚期糖基化终产物(AGEs)对人软骨细胞增殖及自噬活性的影响,并初步探讨其可能机制。方法:(1)不同浓度AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)分别处理人软骨细胞6h,12h,24h,48h,72h后用CCK-8法检测细胞的增殖活性。(2)不同浓度AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)分别处理人软骨细胞6h,12h,24h,48h,72h后采用WesternBlot方法检测细胞内LC3Ⅱ蛋白的表达。(3)不同浓度的AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)处理人软骨细胞24h后,WesternBlot方法检测细胞Beclin1、LC3 Ⅱ、P62蛋白的表达,电子透射显微镜(TEM)观察细胞内自噬小体数目,自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)融合蛋白标记观察细胞内mRFP-GFP-LC3数目。(4)不同浓度的AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)处理人软骨细胞24h后,WesternBlot方法检测细胞mTOR、p-mTOR和PPARy蛋白的表达。(5)人软骨细胞加入PPARγ激动剂吡格列酮和PPARy抑制剂T0070907预孵2h后,再加入200mg/l的AGEs处理24h后,采用WesternBlot方法检测细胞LC3Ⅱ、mTOR和p-mTOR蛋白的表达。结果:(1)50mg/l AGEs和100mg/l AGEs处理组在24h之内细胞生存率明显高于对照组,但在48h之后细胞生存率明显低于对照组。200mg/l AGEs处理组细胞的生存率在6h之内高于对照组,在6h之后细胞生存率低于对照组(p0.05)。50mg/l、100mg/l、200mg/lAGEs处理细胞24h后的细胞生存率分别为1.289±0.011,1.451±0.009,0.663±0.014,组间比较差异具有统计学意义。(2)AGEs处理细胞后,WB结果显示细胞LC3Ⅱ蛋白表达先升高后降低,50mg/l和100mg/l AGEs处理组LC3Ⅱ蛋白的表达24h达到最高值,24h后LC3 Ⅱ蛋白的表达随时间延长逐渐下降;200mg/l AGEs处理组LC3Ⅱ蛋白的表达6h达到最高值,6h后LC3Ⅱ蛋白的表达随时间延长逐渐下降,12h后与对照组比较差异有统计学意义;48h后三组AGEs处理组LC3Ⅱ蛋白的表达均低于对照组,差异有统计学意义。(3)WB检测结果显示,50mg/l和100mg/l AGEs处理24h后细胞内LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达明显高于对照组,P62的表达明显低于对照组。200mg/l AGEs处理24h后细胞内LC3Ⅱ和Beclin1的表达明显低于对照组,而P62的表达高于对照组。透射电子显微镜技术(TEM)及mRFP-GFP-LC3转染结果显示,50mg/l和100mg/l AGEs处理24h后人软骨细胞内的自噬小体数目及GFP-LC3数目明显高于对照组。200mg/l AGEs处理24h后细胞内自噬小体数目及mRFP-GFP-LC3数目明显低于对照组。(4)AGEs处理人软骨细胞24h后PPAR γ的表达明显低于对照组,且随AGEs浓度的增加PPARγ的表达明显降低。50mg/l和100mg/l AGEs处理人软骨细胞24h后p-mTOR的表达明显低于对照组。200mg/l AGEs处理人软骨细胞24h后p-mTOR的表达明显高于对照组。(5)吡格列酮+AGEs 200mg/l组中软骨细胞LC3Ⅱ表达明显高于200mg/l AGEs 组,p-mTOR 表达明显低于 200mg/l AGEs 组。T0070907+ AGEs 200mg/L组中软骨细胞LC3Ⅱ表达明显低于200mg/l AGEs处理组,p-mTOR表达明显高于200mg/l AGEs组。结论:1.AGEs可以影响人软骨细胞的增殖活性和自噬活性,低、中浓度和短时间刺激可以增强软骨细胞的增殖和自噬活性,高浓度和长时间刺激则呈抑制作用。2.AGEs可以通过PPARγ调控mTOR通路影响人软骨细胞的自噬活性。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3
【图文】：

生存率低于对照组（ｐ＜０．００１）。在２４小时时三组ＡＧＥｓ处理组细胞生存率分别逡逑为１．２８９±０．０１１，１．４５１±０．００９，邋０．６６３±０．０１４，组间比较差别具有统计学意义逡逑（ｐ＜０．００１），如图２所示。逡逑逦表１不同ＡＧＥｓ浓度处理软骨细胞后在不同时间点的ＯＤ值逦逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＡＧＥｓ（５０ｍｇ／ｌ）邋ＡＧＥｓ（１００ｍｇ／ｌ）邋ＡＧＥｓ（２００ｍｇ／ｌ）逡逑０逦０．５０６±０．００６逦０．５２３邋±０．００６逦０．５２６±０．００６逦０．５２５邋±０．００７逡逑６ｈ逦１．１８１邋±０．００６逦１．５８４１０．０３１逦１．７１６±０．０２１逦１．５０５±０．０１１逡逑１２ｈ逦２．１９８１０．０４７逦２．５４２１０．０３１逦３．１３７±０．０５９逦２．２０２±０．０４２逡逑２４ｈ逦２．３７２±０．０５７逦２．７５０±０．００９逦３．２０３±０．０７２逦２．１３３±０．０３７逡逑４８ｈ逦３．０６８±０．０９８逦２．９４８±０．０１６逦３．０８２±０．０２１逦２．１３７±０．０４７逡逑７２ｈ逦３．２７３邋±０．１４４逦２．９０４±０．００２

３．２邋ＡＧＥｓ对人软骨细胞自噬活性的影响逡逑不同浓度的ＡＧＥｓ处理软骨细胞不同时间后通过ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ检测细胞内逡逑ＬＣ３ＩＩ蛋白的表达。结果显示（如图３），５０ｍｇ／ｌ和１００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ处理组，细胞逡逑内ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表达在２４小时之内明显高于对照组，２４小时之后明显下降。逡逑２００ｍｇ／ｌ邋ＡＧＥｓ处理组，在６小时之内细胞内ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表达高于对照组，６小逡逑时之后明显下降。逡逑ＡＧＥｓ邋（５０ｍｇ／ｌ）逦２．（Ｈ逦灥逦■邋ｃｏｎ逡逑Ａ邋逦邋Ｄ逦１￣Ｉ邋—逦■邋ａｈ逡逑ｃｏｎ邋６ｈ邋１２ｈ逦２４ｈ逦４８ｈ逦７２ｈ逦Ｉ逦１逡逑逦１逦１．Ｈ逦ＪｊＬ邋■１２ｈ逡逑ＬＣ３邋Ｉ邋－逦－逦—邋＾逦＿邋一邋脏逦■邋２４ｈ逡逑逦邋逦邋邋邋Ｓ逦１邋ｏＪ逦■邋４８ｈ逡逑ＬＣ３＂逦邋｜逦１逦ｍｍ逡逑逦Ｊ邋■邋Ｗｉ逡逑Ｂ，逦ｒ逦ＡＧＥｓ（５０ｍｇ／ｌ）逡逑逦ＡＧＥｓ邋（１ＱＱｍｇ／ｌ）逦邋ｔ逦—逡逑ｃｏｎ邋６ｈ邋１２ｈ邋２４ｈ逦４８ｈ逦７２ｈ逦２？勹逦＊卜广丨■哪逡逑■邋６ｈ逡逑ＬＣ３邋Ｉ邋■丨＿逦—邋■邋■■邋ｍｍｍｍｍ逦■邋１２ｈ逡逑逦逦Ｉ逦■邋２４ｈ逡逑ＬＣ３ＩＩ逦－一邋—逦ｇ邋１．０－逦＾逦■邋４８ｈ逡逑■邋７２ｈ逡逑ＡＧＥｓ（１００ｍｇ／ｌ）逡逑Ｑ逦ＡＧＥｓ邋（２００ｍｇ／ｌ）逦邋Ｆ邋。灼逦■邋ｃｏｎ逡逑ｃｏｎ逦６ｈ一１２ｈ邋２４ｈ逦４８ｈ邋７２ｈ一逦？逦■邋６ｈ逡逑逦１邋0．Ｈ邋＿逦■１２ｈ逡逑ＬＣ３Ｉ邋—？逦碡料“逦Ｂ逦＾丁逦

逑根据Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ条带灰度分析ＬＣ３邋ＩＩ／ＬＣ３邋Ｉ结果，将不同浓度处理组的逡逑ＬＣ３邋ＩＩ蛋白相对表达量与时间的变化关系绘制折线图（如图４）。结果显示，逡逑ＡＧＥｓ处理细胞后ＬＣ３ＩＩ蛋白表达先升高后降低，５０ｍｇ／ｌ和１００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ处理逡逑组ＬＣ３ＩＩ蛋白的表达２４ｈ达到最高值，２４ｈ后ＬＣ３１Ｉ蛋白的表达随时间延长逐逡逑渐下降；２００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ处理组ＬＣ３ＩＩ蛋白的表达６ｈ达到最高值，６ｈ后ＬＣ３ＩＩ逡逑蛋白的表达随时间延长逐渐下降，１２ｈ后与对照组比较差异有统计学意义；４８ｈ逡逑后三组ＡＧＥｓ处理组ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表达均低于对照组，差异有统计学意义。逡逑１．５－１逡逑１．邋ｃｏｎ逡逑５０ｍｇ／ｌ逡逑甲邋１０＿逦十邋１00＿逡逑§逦－ｔ／／逦２００ｍｇ／ｌ逡逑Ｉ逡逑０．０－Ｉ￣Ｉ逦１逦１逦１逦１逦１—逡逑０逦６逦１２逦２４逦４８逦７２逡逑Ｗｉ］（ｈ）逡逑图４ＡＧＥｓ对人软骨细胞ＬＣ３ＩＩ蛋白的表达折线图。不同浓度处理组的ＬＣ３ＩＩ蛋白表达随时逡逑间变化的关系。数据以Ｘ土ＳＥ邋（ｎ邋＝邋３）表示。＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０ｌ，邋＊＊＊ｐ＜０．００ｌ，与对照组逡逑比较。逡逑分别用５０邋ｍｇ／ｌ，邋１００邋ｍｇ／ｌ和２００ｍｇ／ｌ三种不同浓度的ＡＧＥｓ处理人软骨细胞逡逑２４小时后进一步检测Ｂｅｃｌｉｎｌ和Ｐ６２蛋白的表达。结果显示

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 薛庆云;王坤正;裴福兴;朱汉民;金大地;陶天遵;李恩;李宁华;张耀南;王晓滨;纪泉;;中国40岁以上人群原发性骨关节炎患病状况调查[J];中华骨科杂志;2015年12期

2 陈铖;马翅;张莹;肖钧;蔡巍;谭海涛;;AGEs对兔软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响及其机制研究[J];湖南师范大学学报(医学版);2013年04期

本文编号：2793750