miR-126-3p对移植静脉桥血管再内皮化及内膜增生的临床和基础研究

发布时间：2020-08-21 00:33

【摘要】：研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病,coronary heart disease,CHD)是严重威胁人类健康、减低人类寿命的疾病之一,它是最常见的后天性心脏病。20世纪60年代出现的冠状动脉旁路移植术(冠脉搭桥,coronary artery bypass graft,CABG),是现今治疗冠心病最安全、有效的手术方法之一。目前CABG使用最普遍的静脉移植桥血管仍然是自体大隐静脉(human saphenous vein,HSV),采用冠状动脉狭窄远端-HSV-升主动脉吻合的方法是CABG的标准手术方式之一。相关研究表明,约有15%的移植HSV将在CABG术后1年内闭塞,而移植HSV 10年通畅率低于50%-60%。自体HSV桥血管的高堵塞率成为限制CABG手术效果的严重障碍,如何降低HSV桥血管的堵塞发生率已经成为CABG术后一个亟待解决的问题。移植静脉再狭窄是一个复杂的病理生理过程,其基本病理改变是移植静脉桥血管内膜增生,主要病理生理机制是以移植静脉桥血管内膜内皮细胞(endothelial cell,EC)损伤为触发环节,导致内皮下炎症浸润,血管平滑肌(vein smooth muscle cell,SMC)过度增生、异常迁移导致内膜增生,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量分泌沉积进一步致移植静脉内膜增厚、硬化和狭窄,最终导致移植静脉闭塞。众多研究显示,通过促进损伤移植血管内皮细胞功能恢复,能够加速血管再内皮化,从而达到减轻移植静脉内膜增生、改善移植静脉远期通畅率、提高CABG的手术效果的目的。MicroRNAs(miRNAs,miRs)是一类短链非编码小RNA,它通过与mRNA碱基配对结合使其降解或者沉默来抑制蛋白质翻译过程,从而发挥调控各种特异性靶基因的表达的效应。近年来研究发现,内皮特异性miR-126-3p,在血管完整性的维持、血管生成、胚胎血管发育等方面发挥着重要的作用。miR-126-3p基因敲除小鼠可出现血管破裂、出血,部分胚胎致死。已有研究结果证明,在脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中,SPRED-1(sprouty-related EVHl domain-containing protein 1)和 PIK3R2(phosphoinositol-3 kinaseregulatory subunit 2)是 miR-126-3p 的潜在靶基因,同时SPRED-1 和 PIK3R2 基因是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)上游的负性调节因子,而VEGF能够通过增强PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路调节EC细胞的增殖功能、迁移功能和成管能力等。一项体外研究证明内皮微泡(EMPs)介导的miR-126-3p传递能够促进体外培养的冠状动脉内皮细胞的增生和迁移,相关体内实验证实miR-126-3p EMPs能够促进损伤动脉血管的再内皮化。多个有关循环miR-126-3p临床研究发现,血液中miR-126-3p的表达与某些心血管疾病密切相关。稳定性心绞痛CAD患者血清miR-126-3p表达量较正常人降低,miR-126-3p表达量与致死心肌梗死发生呈正相关;2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者血浆miR-126-3p表达下降与DM患者血管并发症的发生相关。目前,miR-126-3p在移植静脉血管桥衰败中的角色尚不清楚,miR-126-3p对移植桥血管内膜增生和再内皮化的研究尚未见报道。研究探讨miR-126-3p在移植静脉血管病变中的作用有着巨大理论的意义和广阔的临床的应用前景,并可能掀起CABG手术后防治移植桥血管衰败的治疗策略的巨大变革。本研究可分为四部分。第一部分循环m i R-126-3p在CABG患者手术前后表达变化及机制的临床研究目的检测CABG患者(严重冠心病需行CABG者)手术前后循环miR-126-3p表达水平变化以及与健康志愿者差异,检测离体培养的大隐静脉血管miR-126-3p表达动态变化,分析可能机制,为miR-126-3p参与CABG患者移植血管病变保护提供临床线索。方法收集健康志愿者与CABG患者术前血液标本,行RT-PCR检测血浆miR-126-3p的表达差异,比较健康志愿者与冠心病人在CABG术前的循环miR-126-3p表达差异。同时,收集冠心病患者行CABG术后1、3、7,14天血液标本,RT-PCR检测CABG患者手术前后miR-126-3p的动态表达变化。收集CABG患者术后剩余大隐静脉片段,对其行离体血管培养0,7,14天,行RT-PCR检测离体培养血管组织miR-126-3p动态表达变化。结果RT-PCR结果显示:CABG患者术前miR-126-3p表达量较正常人明显降低(P0.05)。CABG患者手术后miR-126-3p呈一过性升高,术后3天表达量最高,但与健康志愿者相比表达量仍明显降低。CABG患者术后7-14天左右miR-126-3p表达量逐渐恢复至术前水平。大隐静脉离体培养模型构建成功,RT-PCR结果显示,离体血管miR-126-3p表达呈动态变化,培养7天左右miR-126-3p表达量升高,培养14天左右时miR-126-3p表达量逐渐降低至未培养水平。结论严重冠心病患者血管病变可能与miR-126-3p表达量降低有关;冠心病患者CABG术后miR-126-3p的表达量升高可能与机体的代偿性作用有关;但这种代偿性升高是不完全的。提高miR-126-3p表达水平可能对移植桥血管有益,这需要进一步实验验证。第二部分m i R-126-3p对大隐静脉细胞增殖和迁移功能的影响及相关机制的体外研究目的探讨 miR-126-3p 对大隐静脉内皮细胞(human saphenous vein endothelial cells,HSVECs)增殖和迁移功能的影响,并探讨可能机制及相关通路。平滑肌细胞的增生紊乱并迁移至内膜层以及ECM的沉积导致内膜增生。探讨miR-126-3p的表达变化对大隐静脉平滑肌细胞(human saphenous vein smooth muscle cells,HSVSMCs)的增生和迁移影响,为下一步应用研究做铺垫。方法1.收集CABG术后剩余大隐静脉片段,HSVECs的分离培养采用胶原酶消化法,并应用VWF免疫荧光染色进行鉴定。HSVSMCs的分离培养采用组织块法,并应用α-SMA细免疫荧光染色进行鉴定。2.我们分别采用了 EdU实验、划痕实验、transwell实验评价miR-126-3p对HSVECs增殖和迁移能力的影响。RT-PCR和westemblot检测miR-126-3p的潜在靶基因SPRED-1和PIK3R2的mRNA和蛋白表达变化。同时采用western blot方法检测VEGF相关通路p-ERK、ERK、p-AKT、AKT蛋白的表达变化。3.EdU实验、划痕实验、transwell实验,评估不同浓度的(25-200nmol)miR-126-3p对HSVSMCs增殖和迁移的影响。另外,我们构建了 HSVSMCs的炎症模型,进一步评价了 miR-126-3p在炎症条件(TNF-α)下对HSVSMCs增殖和迁移功能的影响。结果1.成功分离并鉴定了原代HSVECs和HSVSMCs。内皮细胞预转染实验证实,100nmolmiR-126-3pagomir可达到最佳转染效率。EdU实验证实,上调或下调miR-126-3p表达能够增强或抑制HSVECs增殖。同时,划痕实验和transwell实验证实上调或下调mi-126-3p表达可以增强或抑制HSVECs迁移。2.PT-PCR实验证实上调或下调miR-126-3p表达可使miR-126-3p的潜在靶基因SPRED-1和PIK3R2 mRNA表达降低或者升高,western blot实验进一步证实上调或下调miR-126-3p表达可使SPRED-1和PIK3R蛋白表达量降低或者升高。同时western blot实验证实上调或下调miR-126-3p表达,可分别使PI3K/AKT信号通路和MAPK/ERK1/2信号通路磷酸化程度增强或者抑制。3.EdU实验、划痕实验、transwell证实不同浓度的(25-200 nmol)miR-126-3p agomir对HSVSMCs增殖和迁移均没有影响。此外,在TNF-α炎症因子刺激下,不同浓度的(25-200 nmol)miR-126-3p agomir对HSVSMCs增殖和迁移也没有影响。结论1.miR-126-3p通过下调其靶基因SPRED-1和PIK3R2的表达,经ERK和AKT信号通路促进HSVECs增殖和迁移。2.miR-126-3p对HSVSMCs增殖和迁移功能没有影响。第三部分过表达m i R-126-3p对离体培养的大隐静脉血管内膜增生和再内皮化的离体研究目的探讨过表达miR-126-3p对离体培养的大隐静脉内膜增生和再内皮化的影响,为miR-126-3p参与移植血管保护提供进一步实验支持,并为下一步miR-126-3p agomir体内应用提供理论依据。方法收集CABG患者术后残余大隐静脉片段,建立大隐静脉离体培养模型。分为四组:未培养组、对照组(离体培养14天)、NC agomir组(离体培养14天+miR-126-3p negtive control agomir)、miR-126-3p agomir 组(离体培养14天+miR-126-3p agomir)。收集不同组标本,行HE染色评估大隐静脉血管内膜增生状况;行血管内皮层CD31免疫组化染色,评价大隐静脉血管再内皮化情况。结果1.给予离体培养的大隐静脉miR-126-3p agomir能够减轻大隐静脉血管内膜增生;2.给予离体培养的大隐静脉miR-126-3p agomir促进大隐静脉血管再内皮化。结论通过miR-126-3p agomir过表达miR-126-3p能够促进离体大隐静脉内皮化,减轻血管内膜增生,这为miR-126-3p下一步的活体应用研究提供了实验依据。第四部分过表达miR-126-3p对移植静脉桥血管再内皮化和内膜增生的体内研究目的探讨局部应用miR-126-3p agomir对大鼠移植桥血管再内皮化和内膜增生的影响。方法构建自体静脉移植大鼠动物模型,局部转染Cy3标记的miR-126-3p agomir,荧光成像和western blot评价转染效率。实验组分成四组,正常对照组,血管移植组,NCagomir组、miR-126-3pagomir组。血管移植术后28天,行血管彩超评价移植静脉内径和血流动力学改变。HE染色评价内膜增生,Masson染色评价胶原蛋白沉积,PCNA免疫组化、α-SMA免疫组化染色评价VSMC增生情况。Evans染色、CD31免疫荧光评价移植血管再内皮情况,CD68免疫组化评价炎症细胞侵润情况。结果1.成功构建大鼠静脉移植模型,免疫荧光和western blot实验证实局部转染miR-126-3p agomir 效果好。2.大鼠血管彩超检查提示:局部转染miR-126-3p agomir能够减轻大鼠静脉移植血管狭窄,改善移植血管血流动力学。3.HE评价内膜增生染色证实局部给予miR-126-3p agomir与血管移植组,NC agomir组相比明显降低内膜增厚。Masson染色结果提示局部给予miR-126-3p agomir对胶原蛋白沉积无影响。PCNA免疫组化和α-SMA免疫组化结果表明局部给予miR-126-3p agomir可明显改善移植血管内膜平滑肌增生和迁移程度。4.Evans染色、CD31免疫荧光结果表明局部给予miR-126-3p agomir可促进移植血管再内皮化,CD68免疫组化表明,局部给予miR-126-3p agomir可减轻炎症细胞浸润。结论1.局部过表达miR-126-3p能够降低移植血管狭窄,改善血流动力学,其主要机制是miR-126-3p能够促进移植血管再内皮化,减轻炎症反应,从而抑制内皮下VSMC过度增生和异常迁移,减轻移植血管内膜增生。2.miR-126-3p agomir局部转染的方法为移植血管再狭窄的防治提供了新思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.2
【图文】：

逦３邋（３０％）逦１邋（１０％）逦Ｐ＝０．２８７８逡逑图１逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｐｉ邋，逦，逦｜５２＇５］逦＿逦＾逡逑Ｊｉ３＇逦Ｉｆ邋ｉ邋ｉ邋Ｔ逡逑屸ＩＩ逦Ｉ娭逦椨W 晒＿逡逑Ｃ邋，逦，逦Ｄ逡逑ＺＯ－．邋＿＿＿＿＿＿逡逑８》ｉ邋丁逦ｉ＿Ｊ邋？逡逑ＩＩ－逦Ｋ１＇５＇邋＿邋烺墨逡逑Ｐ：Ｌ逦［Ｍ逦ｒｌｌ逦ｌ逦１１逡逑，／邋／／／逡逑图１．邋ｍｉＲ－１２６－３ｐ在ＣＡＢＧ患者和正常人血浆以及在离体培养的大隐静脉中逡逑的相对表达量。（Ａ）正常人与严重冠心病人循环ｍｉＲ－１２６－３ｐ的比较。（Ｂ）ＣＡＢＧ逡逑７６逡逑

ｍｉＲ－１２６－３ｐ表达峰值与正常人比较。（Ｄ）离体培养的大隐静脉模型组织逡逑ｍｉＲ－１２６－３ｐ邋表达呈动态变化。＊Ｐ＜０．５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１（下同）。逡逑图２逡逑Ｄ逦Ｅ逦Ｆ逦逡逑■Ｈ逡逑图２．原代ＨＳＶＥＣｓ的提取与鉴定的典型图片。（Ａ）胶原酶消化法提取原代逡逑ＨＳＶＥＣｓ（Ｂ）原代ＨＳＶＥＣｓ培养１０天后可完全长满，呈椭圆形、梭形，大小不逡逑均一。（Ｃ）邋ＨＳＶＥＣｓ传代３次细胞ＨＳＶＥＣｓ呈典型的铺路石状生长。（Ｄ）邋ＶＷＦ逡逑细胞免疫荧光染色。（Ｅ）ＤＡＰＩ标记细胞核。（Ｆ）细胞免疫染色可见所提取细胞１００％逡逑表达ＶＷＦ。逡逑７７逡逑

逡逑图３逡逑ｆｍｍ逡逑＿＿＿逡逑图３．原代ＨＳＶＳＭＣｓ的提取与鉴定的典型图片。（Ａ）组织块培养法提取原代逡逑ＨＳＶＳＭＣｓ邋（Ｂ）原代ＨＳＶＳＭＣｓ培养３天后可见细胞从组织块爬出，形态多变，逡逑大小可不均一。（Ｃ）邋ＨＳＶＳＭＣｓ培养传代３次后呈平滑肌细胞典型的波峰、波谷逡逑样生长。（Ｄ）ｃｘ－ＳＭＡ细胞免疫荧光染色。（Ｅ）ＤＡＰＩ标记细胞核。（Ｆ）细胞免疫染逡逑色可见所提取细胞１００％表达ａ－ＳＭＡ。逡逑图４逡逑Ａ邋２５ｎｍｏｌ邋Ｂ邋５０ｎｍｏｌ邋Ｃ邋１００ｎｍｏｌ邋Ｄ２００ｎｍｏｌ逡逑■■■■逡逑ｍｕｕｕ逡逑ｍｕｕｕ逡逑图四．不同浓度的Ｃｙ３标记ｍｉＲ－１２６－３ｐ邋ａｇｏｍｉｒ转染原代ＨＳＶＥＣｓ的灭光成像。逡逑７８逡逑

本文编号：2798662