骨碎补总黄酮联合纳米骨材料对成骨细胞增殖分化及血管新生的影响

发布时间：2020-09-17 15:01

　　 目的:研究骨碎补总黄酮(osteopractic total flavone,OTF)联合纳米骨材料(nHAC)对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及血管新生的影响。方法:本研究分为四个部分。第一部分:着重探讨OTF联合nHAC材料对MC3T3-E1细胞形态学改变和凋亡的影响,通过MC3T3-E1成骨细胞与nHAC材料共培养,以骨碎补总黄酮干预,CKK8法测定成骨细胞活性,组织病理染色观察成骨细胞的病理改变,扫描电镜观察成骨细胞超微结构的变化;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡率,观察不同浓度OTF联合nHAC材料对MC3T3-E1成骨细胞体外培养细胞形态学改变及凋亡的影响。第二部分:着重探讨OTF联合nHAC材料诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制,通过PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性,ELISA测定骨钙蛋白(OCN),茜素红染色鉴定,PCR检测成骨相关基因表达,观察成骨钙化作用机制。第三部分:着重探讨OTF联合nHAC材料调控MC3T3-E1细胞Wnt/β-catenin信号通路的效应机制。本部分研究将MC3T3-E1细胞与nHAC材料共培养,以OTF为药物干预,以转化生长因子-β及Wnt通路抑制剂Dickkopf-1干预为正负对照,免疫荧光标记,激光共聚焦扫描显微镜观察成骨细胞Wnt/β-catenin通路中Wnt与LRP结合情况,通过real-time PCR 和 western-blot 技术检测调控 β-catenin,LRP 5,Gsk-3β,Cyclin D1,Runx-2等基因和蛋白表达的改变。第四部分:着重探讨OTF联合nHAC材料对hFOB-人血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养体系中HUVEC生物学功能的影响。建立hFOB-HUVECHE共培养复合nHAC材料,不同浓度OTF干预实验组,染色观察HUVEC形态学观察,CKK8检测HUVEC增殖,Transwell细胞划痕观察HUVEC迁移,ELISA法检测血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纤维细胞生长因子 2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)含量。结果:第一部分:在CKK-8细胞活性测定中,100μg/mL和250μg/mL OTF浓度组明显促进MC3T3-E1成骨细胞增殖,而两种浓度对细胞增殖的影响无显著差异。倒置显微镜下对各组培养细胞观察结果显示,DKK1模型组其成骨细胞生长受到抑制,细胞贴壁数量较其他组明显减少,DKK 1+TGF-β、DKK l+OTF250μg/mL、DKK 1+nHAC+TGF-β、DKK1+nHAC+OTF250μg/mL组要优于正常组、模型组及其他实验组,48h时基本覆盖底部,镜下观察培养瓶中细胞贴壁生长良好,细胞形态成梭形或多角形,核较大呈圆形或椭圆形。SEM培养24小时观察,DKK1模型组成细胞数量较其他组明显减少,三组材料组中的大量细胞组已经粘附在并且已经扩增和增殖,见材料的表面和孔隙内均有细胞附着,细胞已伸展成梭形或多角形,伸出伪足豁附材料上,其中DKK 1+OTF250μg/mL、DKK 1+nHAC+OTF250μg/mL 组较 DKK 1+nHAC+OTF100μg/mL 组细胞生长更好。非材料组DKK 1+TGF-β、DKK 1+OTF250μg/mL组细胞生长数量和表面丝状细胞外基质增多,细胞表面可见大量的微绒毛,部分孔内细胞和分泌的基质融合成片,表示细胞状态良好。48h时,细胞数量增多,可见细胞体表面有颗粒状钙盐结晶沉积,一些细胞被更多矿物质沉积覆盖。AnnexinV/PI双染流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。从24h到48h,随着OTF浓度的增加,MC3T3-E1细胞凋亡率呈现基本平稳趋势。DKK 1+TGF-β、DKK1+OTF250μg/mL、DKK1+nHAC+TGF-β、DKK1+nHAC+OTF250μg/mL 组凋亡率显著低于模型组和正常组,DKK1+OTF100μg/mL、DKK 1+nHAC+OTF100μg/mL 组凋亡率显著低于模型组,实验组组间凋亡率未见显著性差异。第二部分:OTF能够诱导MC3T3-E1细胞进入成骨细胞,提高ALP活性和OCN浓度,同时升高MC3T3-E1细胞培养物中Col-I,OPN和OCN mRNA的表达和蛋白表达水平。100μg/mL和250μg/mL浓度组OTF的成骨能力没有显著差异,但显著高于其它组的成骨能力。第三部分:在24小时、48小时之后分别检测β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX2及CyclinD1基因及蛋白水平表达的变化。24小时和48小时后DKK1+TGF-β、DKK 1+OTF 100μg/mL、DKK 1+OTF250μg/mL 三组的 β-catenin、LRP5、Runx2 及 CyclinD1基因及蛋白表达较正常组、模型组明显增加,GSK3β基因及蛋白表达明显降低,统计学有显著性差异;DKK1+TGF-β、DKK1+OTF250μg/mL 二组的 β-catenin、LRP5、Runx2及CyclinD1基因及蛋白的表达水平明显高于DKK 1+OTF 100μg/mL组。第四部分:CKK8结果显示成骨细胞培养上清液对HUVEC细胞增殖有促进作用可能性较大,OTF对HUVEC细胞增殖促进作用无统计差异,nHAC材料对两种细胞的贴附、生长和增殖均无影响,表明该材料具有良好的生物相容性。ELISA结果表明成骨细胞能够分泌FGF-2,且结合CCK8的结果来看,FGF-2含量与HUVEC细胞的增殖能力呈现大致相同的趋势,对VEGF分泌物无明显作用。结论:(1)通过OTF联合nHAC材料对鼠成骨细胞的不同组别体外复合培养的初步研究,细胞增殖活性实验、细胞凋亡检测及形态学观察的结果较一致,相互验证,表明实验组细胞的良好功能状态,观察到OTF 100pg/mL和250μg/mL浓度组提高成骨细胞黏附、增殖活力最佳并保持其正常细胞形态,随着培养时间的延长,生长趋势越好,具有明显地剂量依赖和时间依赖。(2)nHAC材料具备很好的生物相容性,对细胞无毒性,而且中药OTF复合nHAC材料能促进成骨细胞增殖,抑制凋亡,保持正常的细胞形态,但其成骨效应有待进一步研究。(3)OTF能够诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,提高ALP活性和OCN浓度,同时升高MC3T3-E1细胞培养物中Col-I,OPN和OCNmRNA的表达和蛋白表达水平。浓度为100μg/mL和250μg/mL的OTF可以有效促进MC3T3-E1细胞的分化、矿化。(4)通过体外培养MC3T3-E1细胞与nHAC复合体,OTF诱导培养后具有成骨细胞的活性及生物学特性,适宜作为构建组织工程骨的种子细胞和三维条件下进行细胞实验的研究对象。(5)OTF能明显促进成骨细胞的分化增殖,促进骨形成及骨矿化,并且可增加β-catenin、LRP5、RUNX2的表达,下调GSK3β的表达,可以推测OTF通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞产生促进作用,这是可能作用机制之一。(6)nHAC材料具有良好的细胞结合能力,hFOB-HUVEC在支架材料上共培养,可以良好的进行贴附、生长和增殖。(7)HUVEC的增殖可能与成骨细胞分泌FGF-2有关,而OTF对成骨细胞分泌FGF-2没有促进作用。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R68
【部分图文】：

图１－１纳米晶磷酸钙／胶原基骨材料（ｎＨＡＣ）电镜观察逡逑１．２．２实验药物逡逑（１）骨碎补总黄酮（ｏｓｔｅｏｐｒａｃｔｉｃ邋ｔｏｔａｌ邋ｆｌａｖｏｎｅ，ＯＴＦ）逡逑ＯＴＦ购自于北京岐黄医药股份有限公司（国药准字Ｚ２００３０００７，生产批号：０４０８００８１，逡逑含量＞８０％），质谱（ＭＳ）邋（Ｅｓｑｕｉｒｅ邋６０００，邋Ｂｒｕｋｅｒ，德国）鉴定本次实验用药，鉴定条件逡逑如下：离子源为ＥＳＩ，雾化压力为３５ｐｓｉ，干燥气体流量为ｌｌｍｌ／ｍｉｎ，干燥温度为３５０°Ｃ，逡逑质量范围质谱分析为ｌ00－ｌ000ａｍＵ，离子模式为阴性（见图卜２）。ＯＴＦ溶液的配制：（１）逡逑用含３％ＦＢＳ的ｃｔ－ＭＥＭ培养基将ＯＴＦ配成５００ｍｇ／ｍｌ溶液，４°Ｃ保存；（２）用含３％ＥＢＳ逡逑的邋ｏｔ－ＭＥＭ邋培养基将邋ＯＴＦ邋溶液浓度稀释成邋１０００ｐｇ／ｍＬ、５００｜ａｇ／ｍＬ、２５０｜ｉｇ／ｍＬ、１００｜＿ｉｇ／ｍＬ、逡逑５０｜ｉｇ／ｍＬ、Ｏｐｇ／ｍＬ，现用现配。逡逑（２）逦ＤＫＫ１邋（５７２４８－Ｍ０８Ｈ）：邋Ｓｉｎｏ邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋公司（美国）逡逑药物浓度配制：①在ＤＫＫ－１中加入３％ＦＢＳ的ｃｔ－ＭＥＭ培养基７０叫，使ＤＫＫ１溶逡逑0．１５ｍ／ｍｌ；ＤＫＫ１４°Ｃ，１２０００ｒｍ心３０ｓ；入３％逡逑

１．３小鼠ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞获取及与ｎＨＡＣ材料共培养逡逑１．３．１逦ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋细胞培养逡逑用含１０％ＦＢＳ的ａ－ＭＥＭ培养基培养小鼠成骨细胞前体细胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１并置于逡逑３７°Ｃ，邋５％Ｃ０２恒温培养箱中，待培养瓶中细胞覆盖率达到８０％－９０％时传代。逡逑１．３．２逦ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋细胞传代逡逑（１）将细胞从培养箱中取出至超净台，并将原有培养基吸尽；逡逑（２）用过滤除菌的ＰＢＳ将细胞清洗３遍，０．２５％邋ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ，３７°Ｃ，消化３０ｓ；逡逑（３）在细胞变圆后加入完全培养基终止其消化；逡逑（４）细胞在移液器吹打至均匀悬浮后移至１５ｍｌ离心管中，ｌＯＯＯｒｍｐ离心５ｍｉｎ；逡逑（５）弃去上清，加入２ｍｌ培养基后，重悬；逡逑（６）将细胞在重悬后以１：３接种到新细胞培养瓶中，置３７°Ｃ，邋５％Ｃ０２饱和湿度培养逡逑箱。逡逑１．３．３逦ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋细胞冻存逡逑

逦骨碎补总黄酮联合材料对成骨细胞增殖分化及血管新生的影响逦逡逑１．９统计方法逡逑本次实验数据分析运用ＳＰＳＳ邋２０软件进行统计和分析，结果用均值加减标准差表示，逡逑对数据先做正态和方差齐检验，符合者用单因素方差分析比较，组间比较用ＬＳＤ分析逡逑法。若不符合正态分布或方差不齐者，用非参数检验。户＜0．0５为有统计学差异。逡逑２结果逡逑２．１不同浓度骨碎补总黄酮对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞活性的影响逡逑如图１－３所示ＣＫＫ－８检测结果：随培养时间的增加，０｜ｉｇ／ｍＬ、５０｜ａｇ／ｉｎＬ、１００（ａｇ／ｍＬ、逡逑２５０ｐｇ／ｍＬ浓度组ＯＴＦ刺激后ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞的数量递增，５００｜＿ｉｇ／ｍＬ、１０００｜ａｇ／ｍＬ浓度逡逑组ＯＴＦ刺激后ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞数量递减。在２４ｈ和４８ｈ后ｌＯＯ＾ｇ／ｍＬ和２５0ｎｇ／ｍＬ邋ＯＴＦ逡逑浓度组细胞活性均显著高于其它组ＣＰ＜0．0５），邋１０0ｎｇ／ｍＬ和２５０｜＿ｉｇ／ｍＬ两组之间没有显著逡逑性差异（办0．0５）。空白组比较＊尸＜０．０５＊＊户＜０．０１。逡逑

【参考文献】

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本文编号：2820871