非受体酪氨酸激酶BMX对LPS刺激巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α和吞噬功能的影响

发布时间：2020-09-29 12:17

　　一、研究背景烧伤创面由于存在大量的坏死和变性组织,细菌定植不可避免。革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌菌、大肠埃希菌、克雷伯杆菌等)引起的感染有逐渐增多的趋势。非受体酪氨酸激酶BMX(bone marrow tyrosine kinase on chromosome X)简称骨髓激酶X,是Tec家族成员之一。Tec家族激酶是近年来国内外研究的“明星蛋白”,是非受体酪氨酸激酶第二大家族。BMX激酶最初发现和肿瘤的发生发展密切相关。它广泛表达于骨髓造血细胞、淋巴细胞、上皮细胞及内皮血管细胞和某些恶性肿瘤细胞(前列腺癌、乳腺癌和肾细胞癌等),并参与炎症反应和多种细胞内信号转导,在细胞免疫、发育、增殖和凋亡过程中起着重要作用。近年来研究表明,BMX激酶与一些慢性炎症性疾病、免疫系统疾病(类风湿关节炎)和创伤(脑再灌注损伤)等的发生相关。巨噬细胞存在于所有组织中,并在发育,体内平衡,组织修复和免疫中发挥重要作用。巨噬细胞作为固有免疫的重要组成部分,在许多组织中有重要的作用,在不同的组织中巨噬细胞命名不同,包括小胶质细胞,组织细胞,破骨细胞,肺泡巨噬细胞,枯否细胞等单核-巨噬细胞系统是重要的抗原递呈系统,两者(单核细胞为巨噬细胞前体)有不同的抗原识别与递呈能力,巨噬细胞通过微丝参与的胞吞作用中的吞噬作用,激活特异性免疫系统。研究表明革兰氏阴性菌的内毒素在创面感染以及脓毒症的发生发展中都有重要作用,本实验以巨噬细胞系RAW264.7细胞为实验材料,用大肠杆菌的LPS诱发细胞炎症反应,并用特异性抑制剂BMX-IN-1进行干预,观察非受体酪氨酸激酶BMX对LPS刺激巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α和吞噬功能的影响及其可能分子机制,以进一步阐明在烧伤后天然免疫巨噬细胞在炎症反应中作用,并对烧伤后感染防治提供意见。二、研究目的探讨非受体酪氨酸激酶BMX对LPS刺激巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α分泌和吞噬大肠杆菌的影响。三、研究内容第一部分非受体酪氨酸激酶BMX在炎症环境下表达的时间效应巨噬细胞系RAW264.7制成单细胞悬液,培养于48孔板,1*106/孔。实验分组:0min组、15min组、30 min组、60 min组和120 min组。10ng/ml LPS刺激,不同时间梯度,流式细胞术检测TNF-α的分泌量,以及Western blot法检测P-BMX蛋白表达。第二部分非受体酪氨酸激酶BMX在LPS诱导巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α产生中的作用及信号通路巨噬细胞系RAW264.7制成单细胞悬液,培养于48孔板,1*106/孔。实验分组:空白对照组、LPS组、25μmol/L+LPS组、75μmol/L+LPS组。LPS组用10ng/ml LPS刺激1 h。后2组预先用适宜剂量的BMX-IN-1处理12h,再用10ng/ml LPS刺激1 h,流式细胞术检测TNF-α的分泌量,Western blot法检测BMX、P-JNK蛋白表达。第三部分非受体酪氨酸激酶BMX在炎症环境下对巨噬细胞吞噬能力的影响巨噬细胞系RAW264.7制成单细胞悬液,培养于48孔板,1*106/孔。摇菌过夜,E.coli带绿色荧光,分光光度计测OD值。RAW264.7细胞:E.coli=1:50。实验分组:空白对照组、LPS组、75μmol/L+LPS组。75μmol/L+LPS组预先用75μmol/LBMX-IN-1处理12h,LPS组和75μmol/L+LPS组用LPS刺激2小时,三组同时加入等量的E.coli吞噬两小时。流式细胞术检测巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬百分率。四、研究结果第一部分非受体酪氨酸激酶BMX在炎症环境下表达的时间效应10ng/ml LPS刺激(0、15、30、60、120 min),流式细胞术检测到TNF-α(7.96%、25.93%、42.61%、53.63%、70.71%)。10ng/ml LPS刺激15min,Western blot可见P-BMX条带最亮。第二部分非受体酪氨酸激酶BMX在LPS诱导巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α产生中的作用及信号通路(1)Graph Pad Prism软件单因素方差分析,75μmol/L BMX-IN-1+LPS组和LPS组,q=5.337,P0.01;75μmol/L BMX-IN-1+LPS组和25μmol/L BMX-IN-1+LPS组,q=3.960,P0.05;75μmol/L BMX-IN-1+LPS组和空白对照组,q=21.07,P0.001,均具有统计学意义。(2)Western blot可见BMX和P-JNK条带亮度减弱,并用Image J和Graph Pad Prism软件做单因素方差分析,BMX/β-Actin,P-JNK/β-Actin结果一致第三部分非受体酪氨酸激酶BMX在炎症环境下对巨噬细胞吞噬能力的影响。在炎症环境下,流式细胞术检测巨噬细胞对大肠杆菌吞噬百分率,Graph Pad Prism软件做单因素方差分析,LPS组和75μmol/L+LPS组,q=0.2535,P0.05,无统计学意义。五、研究结论(1)非受体酪氨酸激酶BMX在炎症反应中可能通过JNK途径,促进LPS刺激巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α。(2)非受体酪氨酸激酶BMX对LPS刺激巨噬细胞的吞噬功能没有统计学意义。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R644
【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分：在炎症环境下非受体酪氨酸激酶BMX表达的时间效应
    材料和方法
    结果
    讨论
第二部分：非受体酪氨酸激酶BMX在LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α产生中的作用
    材料和方法
    结果
    讨论
第三部分：非受体酪氨酸激酶BMX在炎症环境下对巨噬细胞吞噬能力的影响
    材料和方法
    结果
    讨论
参考文献
全文小结
附录
致谢
综述
    参考文献

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