张力性刺激对人髓核细胞表达软骨层间蛋白的调控及机制

发布时间：2020-10-21 20:25

　　 目的:探索张力性刺激对人椎间盘髓核细胞分泌软骨层间蛋白(cartilage intermediate layer protein,CILP)的影响及其机制。方法:选取2016年6月在我院因创伤性骨折行L4/5椎间盘摘除及相邻椎体融合手术的1例38岁男性患者的髓核组织作为细胞来源,术前MRI示该节段椎间盘组织改良Pfirrmann分级为Ⅱ级,分离培养其中的髓核细胞并传代至第3代,进行力学实验。使用Flexcell 5000系统通过电脑控制气压变化来使载有细胞的塑料膜发生形变,进而对膜载体上的细胞给予不同强度、时长的张力性力学加载。实验组分为4组,均以10%的拉伸量为刺激强度,给予不同时长(6h、12h、24h、48h)的刺激,空白对照组不给予任何刺激。利用RT-q PCR技术检测各组CILP的基因表达量,选出表达变化最为明显的一组,以该组的刺激时长为限,再将实验组分为3组,分别给予不同刺激强度(5%、10%、20%)的张力刺激,空白对照组不给予任何刺激,利用RTq PCR技术检测各组CILP的基因表达。选取相比较于对照组CILP增长效应最明显的力学强度和时长作为刺激条件,测定髓核细胞在该实验条件下smad3的磷酸化程度,并对髓核细胞预先给予smad3磷酸化的特异性抑制剂SIS3处理后再置于同一力学条件下,以RT-q PCR检测CILP的基因表达量,以此观察smad信号通路是否介导了张力性刺激对于髓核细胞CILP表达的调控。实验结果使用配对t检验以及单因素方差分析进行组间比较。结果:RT-q PCR结果显示,相较于空白对照组,不同刺激时长的10%张力性刺激均明显下调了CILP的表达,其中在刺激48h后对CILP的抑制效应达到最大(P0.05);5%的张力性刺激48h后髓核细胞的CILP基因相对表达量与对照组比较无统计学差异(P0.05),10%的张力刺激48h明显降低CILP的表达(P0.05),20%的张力刺激48h显著提高CILP表达量(P0.05)且smad3的磷酸化水平相对于空白对照组明显增高;相对于只给予20%张力刺激的对照组,先给予SIS3预处理再给予相同力学刺激的实验组的CILP表达水平显著下调(P0.05)。结论:张力性刺激调控髓核细胞的CILP表达,调控效应随着刺激时长和刺激强度的变化而不同;smad信号通路参与高强度的张力性刺激对CILP的上调效应。
【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 主要材料与试剂
    1.2 髓核细胞的分离培养
    1.3 张力性力学加载
    1.4 smad3特异性抑制剂的使用
    1.5 RNA的提取和RT-q PCR
    1.6 smad3的磷酸化检测
    1.7 统计学分析
2 结果
    2.1 不同时长的10%张力性刺激后髓核细胞CILP的基因相对表达
    2.2 不同强度的张力性刺激48h后髓核细胞CILP的基因相对表达
    2.3 高强度张力刺激下smad3的磷酸化及抑制smad3磷酸化后CILP的相对基因表达
3 讨论

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