Sestrin2对深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响及机制研究

发布时间：2020-10-24 13:45

　　 研究背景烧伤创面的治疗一直是烧伤医学临床和实验研究的重点。临床工作中,通常利用三度四分法进行烧烫伤的分度,并指导患者的治疗。Ⅰ度及浅Ⅱ度烧伤通常经过保守治疗可以治愈,Ⅲ度烧伤通常需要植皮或皮瓣覆盖等手术治疗,而深Ⅱ度烧伤介于两者之间。深Ⅱ度烧伤创面愈合时间长,愈后形成瘢痕,且治疗过程中容易并发感染导致创面加深。因此,阐明深Ⅱ度烧伤创面的愈合机制及寻求创面愈合的有效治疗方法仍是目前亟需解决的重要问题。创面愈合是一个多种细胞及细胞因子参与的过程,主要分为炎症反应期、新生组织形成期、组织重塑期三个不可分割的阶段。既往研究显示,调控炎症反应、加速创面上皮化可以促进创面愈合的进程。Sestrin2(SESN2)属于sestrin家族,是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的应激诱导蛋白,具有调节代谢、抗老化和抑制肥胖等功能。研究表明当细胞受到DNA损伤、氧化应激、低氧等刺激时,SESN2表达显著升高,通过抑制炎症反应、调节自噬、对抗氧化应激、维持细胞内稳态等发挥保护细胞的作用。近来研究发现SESN2在多种疾病中调节免疫反应并促进炎性损伤后上皮细胞的恢复。课题组前期实验结果显示:深Ⅱ度烧伤后创面SESN2 mRNA及蛋白表达水平升高,提示SESN2在创伤愈合中发挥作用。由此,我们提出如下假说:深Ⅱ度烧伤后创面SESN2表达升高,通过抑制创面炎症因子的释放抑制炎症反应,并通过促进角质形成细胞增殖、迁移促进创面愈合。为探讨SESN2在深Ⅱ度烧伤创面愈合中的作用,本研究拟通过建立动物深Ⅱ度烧伤创面模型,局部给予SESN2的激动剂eupatilin以及转染SESN2的干扰RNA(si-SESN2),调控创面局部SESN2的表达水平,在体观察SESN2对创面愈合炎症及组织增生阶段的影响,并通过体外细胞实验,进一步探讨相关的细胞分子机制。研究目的通过对SESN2在深Ⅱ度烧伤小鼠创面炎症反应期及新生组织形成期表达规律的观察分析,研究确定SESN2在深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中的作用,并深入探讨相关的细胞分子机制,为临床寻找有效的深Ⅱ度烧伤创面治疗途径提供实验依据。实验方法1.建立C57BL/6深Ⅱ度烧伤模型。C57BL/6小鼠随机分为4组,包括正常对照组和烧伤2 s、4 s、6 s实验组。小鼠背部脱毛处理后24 h,采用92℃热蒸汽在3个实验组小鼠背部制作直径1.5 cm的圆形创面,分别烧伤2 s、4 s、6 s,每组于伤后即刻及伤后12 h、24 h、48 h留取创面区域全层皮肤标本,制作石蜡切片,行HE染色观察确定不同致伤条件组动物皮肤烧伤深度。2.观察SESN2在深Ⅱ度烧伤创面的表达变化。制作C57BL/6背部深Ⅱ度烧伤创面,分别于伤后12 h、24 h、2 d、4 d、7 d取材,通过Real-time PCR、免疫组化及Western blot等方法检测创面组织SESN2的表达变化,同时检测伤后炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及细胞增殖标志物Ki-67的表达水平。3.通过应用SESN2激动剂或干涉SESN2,观察深Ⅱ度烧伤创面愈合中SESN2的作用。将C57BL/6小鼠分为4组,对照组、eupatilin注射组、si-NC注射组和si-SESN2注射组,脱毛后分别以生理盐水、eupatilin、si-NC或si-SESN2注射于小鼠背部皮肤。24 h后于小鼠背部注射处理区域制作深Ⅱ度烧伤创面,此后每隔24 h在各组小鼠背部创面周围注射生理盐水、eupatilin、si-NC或si-SESN2,直至创面愈合。观察并记录创面愈合情况。以Real-time PCR、免疫组化及Western blot等方法检测SESN2在创面愈合中对炎症反应及细胞增殖迁移的影响,分析确定SESN2在深Ⅱ度烧伤创面愈合中的作用。4.SESN2在热处理后的HaCaT细胞中的表达变化及其对角质形成细胞增殖、迁移的影响。首先,HaCaT细胞热处理后通过Real-time PCR及Western-blot检测SESN2的表达变化。再将HaCaT分为对照组、eupatilin组、si-NC组及si-SESN2组,通过Real-time PCR明确热处理后SESN2对细胞炎症因子表达的影响,以EDU实验、CCK-8实验观察热处理后SESN2对角质形成细胞增殖的影响,划痕实验、Transwell实验观察热处理后SESN2对角质形成细胞迁移能力的影响。5.SESN2促进深Ⅱ度创面愈合的作用机制研究。通过对HaCaT细胞SESN2表达的调节,观察AMPK、NF-κB、ERK信号通路分子的磷酸化状态,探讨SESN2对促进深Ⅱ度烧伤创面愈合可能的分子机制。实验结果1.HE染色显示4 s烧伤组小鼠皮肤表皮全层及真皮深层损伤,但有毛囊、皮脂腺残存,伤后24 h创面损伤程度稳定,符合深Ⅱ度烧伤创面组织损伤病理诊断标准。2.免疫组化结果显示C57BL/6小鼠皮肤创缘部位SESN2染色最明显,伤后24h染色最深。创缘部位皮肤组织行Real-time PCR及Western blot检测结果显示,烧伤后SESN2的mRNA及蛋白表达量均呈一过性升高,伤后24 h达到峰值(P0.05),随后逐渐下降至7 d时SESN2表达与对照组无显著性差异(P0.05)。伤后24 h TNF-α、IL-1β、IL-6水平较对照组明显升高且有显著差异(P0.01),HE染色显示真皮层炎症小体明显增多。Ki-67表达量在伤后4 d高于对照组且有显著差异(P0.05),伤后7 d即降低至与对照组无差异(P0.05)。3.计算创面剩余面积占最初烧伤面积的百分比,分析比较组间创面愈合率。与对照组相比,si-SESN2组创面愈合速度在7 d、21 d时均显著降低(P0.05)。eupatilin处理组与对照组相比,在伤后7 d内愈合速度无明显差异,但是第14 d和第21 d时,eupatilin处理组的愈合率显著高于对照组(P0.01)。结果提示SESN2在深Ⅱ度烧伤创面中具有促进伤口愈合的作用。4.Real-time PCR证实C57BL/6小鼠si-SESN2组创面中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著升高(P0.01),Ki-67的表达明显降低(P0.01),提示SESN2低表达使深Ⅱ度烧伤创面发生过度炎症反应、降低细胞增殖能力。5.HaCaT细胞热处理后,SESN2的mRNA表达在1 h出现一过性升高随即下降,4 h后表达即与对照组无差异。Western blot结果同样显示细胞热处理后SESN2蛋白水平一过性升高,峰值出现在处理后2 h(P0.01)。Real-time PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6结果显示,eupatilin处理组炎症因子水平较对照组显著降低(P0.01),而si-SESN2处理组则显著高于对照组(P0.01);划痕实验及Transwell实验证实,给予eupatilin提高SESN2表达可以增强HaCaT细胞的迁移能力,而si-SESN2处理组细胞迁移速率减慢;CCK8实验及EDU实验证实干涉SESN2抑制角质形成细胞的增殖能力。6.对SESN2/AMPK/NF-κB通路研究结果显示,同空白对照组相比,上调SESN2的表达可以提高AMPK磷酸化水平,抑制NF-κB的磷酸化。而给予AMPK抑制剂后虽然NF-κB磷酸化水平升高,但通过上调SESN2表达不能抑制NF-κB磷酸化。对SESN2/ERK通路研究显示,上调SESN2表达可以促进ERK磷酸化,转染si-SESN2后ERK磷酸化水平下降。提示SESN2通过调节AMPK/NF-κB信号通路抑制炎症反应,同时可激活ERK信号通路促进角质形成细胞增殖、迁移过程。研究结论1.使用92℃热蒸汽对C57BL/6小鼠背部皮肤持续烧伤4 s,可以获得稳定的深Ⅱ度烧伤模型。2.提高深Ⅱ度烧伤创缘组织中SESN2表达,可以促进C57BL/6小鼠创面愈合。3.SESN2通过抑制炎症反应、促进角质形成细胞迁移和增殖的方式促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合。4.SESN2通过AMPK/NF-κB信号通路发挥抑制炎症的作用,通过ERK信号通路发挥促进角质形成细胞增殖和迁移的作用。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R644
【部分图文】：

图 1. 烧伤创面组织病理损伤分度（杨宗城. 烧伤治疗学. 人民卫生出版社, 2006.8）2. 深Ⅱ度烧伤的形态学变化及愈合方式深Ⅱ度烧伤存在真皮网状层损伤，但深层的真皮组织及其中的部分皮肤附件结构仍健在。肉眼可见表皮及真皮组织凝固坏死、形成黄白色痂皮，痂皮内散在红点，此为残存的皮肤附件周围充血的毛细血管丛。镜下可见细胞凝固型坏死达到全部表皮层和深部真皮层，原有组织结构消失，坏死、肿胀的胶原纤维发生融合，部分皮肤附件轮廓可见。深Ⅱ度烧伤于受伤 12 小时后，大量白细胞浸润于坏死组织和存活组织之间，形成“浸润带”，此后痂皮会沿浸润带脱离，新生上皮沿浸润带延伸；残存的皮肤附件上皮再生出现新生上皮而后形成上皮岛，上皮岛扩大、融合促使创面愈合。二、创面愈合

-17-图 2. 创面愈合过程(Gurtner GC, et al. Wound repair and regeneration. Nature, 2008;453,314-32炎症反应炎症反应在组织愈合过程中起着不可或缺的作用，是体内平衡重建的基损伤后，坏死碎片、凝血反应和侵入体内的微生物共同激活通过局部释而传播的炎症反应（图 3）。炎症反应从血管内嗜中性粒细胞通过滚动、

空军军医大学硕士学位论文式与血管内皮相互作用开始，随后中性粒细胞在受到几种具细胞膜蛋白改变的炎症介质影响的情况下向病灶聚集[26]。在，嗜中性粒细胞被募集并通过释放细胞质颗粒中所含的蛋白子介导组织损伤[27]。这些细胞产生 ROS 及抗微生物蛋白酶，帮[28]，并随后协调组织修复反应。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙超;李罗珠;陈传俊;罗斌杰;田甜;刘闪;焦宏波;;深Ⅱ度烧伤创面修复中富含血小板血浆外敷的应用研究[J];临床医药文献电子杂志;2018年85期

2 蔡景宁;孙玉静;谢晓繁;李斌;邹晓防;;重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶对深Ⅱ度烧伤创面溶痂的效果分析[J];中国临床医生杂志;2017年01期

3 过云;;外用亲水性纤维含银敷料治疗深Ⅱ度烧伤创面临床分析[J];贵州医药;2016年12期

4 覃秋海;;深Ⅱ度烧伤创面处理和修复的研究进展[J];临床医学;2017年04期

5 韩悦;任杰;伍锦华;汪阳;;重组人表皮生长因子联合磺胺嘧啶锌凝胶治疗深Ⅱ度烧伤创面的疗效观察[J];广西医科大学学报;2017年09期

6 刘薇;彭金霞;蔡希雯;;亲水性银离子敷料与磺胺嘧啶银治疗深Ⅱ度烧伤创面效果比较[J];齐鲁医学杂志;2017年04期

7 周牮;李影学;迟云飞;;表皮生长因子溶液配合负压封闭引流技术治疗深Ⅱ度烧伤创面的疗效观察[J];感染、炎症、修复;2015年01期

8 刘华;陶宏军;;血清促红细胞生成素水平与深Ⅱ度烧伤创面愈合关系的临床研究[J];现代医学;2014年06期

9 刘继松;赵经纬;杜娟;章祥洲;方勇;;重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶对深Ⅱ度烧伤创面溶痂的影响[J];蚌埠医学院学报;2014年07期

10 张建芬;金敏;何小莺;;中草药离子喷雾和手法按摩联合康复训练在腋部深Ⅱ度烧伤创面愈合患者中的应用效果[J];护理与康复;2013年02期

相关博士学位论文 前1条

1 杨敏烈;TIR/BB环拟似物AS-1调控深Ⅱ度烧伤创面愈合质量的实验研究及其临床应用策略初探[D];南京医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 王克甲;Sestrin2对深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响及机制研究[D];中国人民解放军空军军医大学;2018年

2 李岩;肝素应用于深Ⅱ度烧伤创面的临床研究[D];山东大学;2008年

3 吴鹏;肝素钠治疗深Ⅱ度烧伤创面的临床研究[D];青岛大学;2007年

4 李荻;钢丝球磨痂治疗小儿深Ⅱ度烧伤创面的临床应用[D];山东中医药大学;2007年

5 张颖涛;甲硝唑对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响[D];四川大学;2004年

6 李守春;削痂保留部分变性真皮治疗小儿深Ⅱ度烧伤创面的临床与基础研究[D];广西医科大学;2011年

7 张艳阁;参附注射液对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响[D];四川大学;2005年

8 韩潇扬;脱痂软膏治疗深Ⅱ度烧伤创面的疗效与安全性评价[D];第二军医大学;2017年

9 刘涛;精氨酸与纤维连接蛋白联合应用对深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响的研究[D];河北医科大学;2008年

10 杨长伟;人碱性成纤维细胞因子、角朊细胞生长因子真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达[D];第二军医大学;2006年

本文编号：2854544