IL-10-hAMSCs对巨噬细胞表型转化及共培养上清液对成纤维细胞的影响研究

发布时间：2020-10-29 07:22

　　目的:探讨IL-10修饰的人羊膜间充质干细胞(IL-10-hAMSCs)在体外共培养对巨噬细胞表型转化及其共培养上清液对成纤维细胞纤维化相关因子表达的影响,为进一步将IL-10-hAMSCs用于创面炎症调控及促进创面愈合提供前期研究资料。方法:(1)采用胰蛋白酶-胶原酶两歩消化法提取原代hAMSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培养基继续培养传代,过程中利用差速贴壁法纯化hAMSCs,经过流式细胞术、波形蛋白(Vimentin)免疫荧光鉴定hAMSCs。(2)取生长状态良好的P3代hAMSCs,按照预实验测得的MOI=30向孔板中添加稀释后病毒液,根据细胞状态在8~12h后换液。继续培养72h后在倒置荧光显微镜观察荧光估计转染率。(3)分离小鼠皮肤成纤维细胞,并利用波形蛋白免疫荧光鉴定。腹腔灌洗法提取C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬细胞并利用墨汁吞噬实验鉴定。经过IFN-γ和LPS诱导24 h获得M1型巨噬细胞。(4)将上述小鼠腹腔巨噬细胞与hAMSCs分组共培养,实验组分为:A组:空白对照组(单纯添加培养基)+小鼠腹腔巨噬细胞组;B组:hAMSC+小鼠腹腔巨噬细胞组;C组:IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬细胞组;D组:空质粒-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬细胞组;分别于培养0d、1d、3d收集上清,用ELISA法检测上清液中IL-12、Arg-1及IL-10含量。同时收集相应时间点的巨噬细胞,利用CD16/CD32(M1型巨噬细胞表面分子)及CD206(M2型巨噬细胞表面分子)为标记,利用流式细胞术对各组巨噬细胞的M1/M2极化状态进行检测。(5)分别取A、B、C、D组培养上清液对小鼠皮肤成纤维细胞进行培养,利用CCK8试剂盒对A、B、C、D组成纤维细胞进行增殖率检测,并绘制生长曲线。分别于培养3d和5d两个时间点收集细胞,利用qPCR和Western blot对TGF-β1、I型胶原、III型胶原mRNA表达情况及蛋白含量进行检测。结果:(1)利用胰蛋白酶-胶原酶两歩消化法可获得大量原代hAMSCs,经过差速贴壁法可获得大量高纯度hAMSCs,原代细胞形态多样,呈纺锤状多突起,短梭形或多角形,排列紊乱,纤维样生长。经过传代培养后形态呈长梭形或纺锤状,旋涡状生长,具有方向性。P3代羊膜间充质干细胞(hAMSCs)流式细胞术鉴定结果提示:CD105(98.58%)、CD73(99.54%)、CD44(96.23%)、CD90(96.88%),呈阳性。IL-10-hAMSCs流式细胞术鉴定结果:CD105(96.67%)、CD73(99.67%)、CD44(95.20%)、CD90(98.50%),呈阳性。两种细胞CD34+11b、+19+45+HLA-DR均呈阴性表达。免疫荧光提示Vimentin在hAMSCs中高表达,而不表达CK19。(2)慢病毒感染P3代hAMSCs细胞,经72h后于倒置荧光显微镜下观察,IL-10慢病毒及空质粒感染hAMSCs均表达均匀的绿色荧光,病毒感染效率可达到90%。CCK8法绘制生长曲线提示:hAMSCs、空质粒-hAMSCs细胞及IL-10-hAMSCs在经历了1~2天缓慢生长以后,在3~6天进入对数生长期,第6天进入平台期,曲线呈现“S”形,转染后的细胞增殖能力略有下降。(3)经过酶消化法成功获取大量的成纤维细胞,体外快速贴壁生长,原代细胞呈现短棒状、长梭形、多角形及不规则形状。Vimentin免疫荧光提示获取了较高纯度的成纤维细胞。巨噬细胞呈椭圆形、短梭形及不规则形态等,墨汁吞噬实验阳性,吞噬百分率可达89%。(4)hAMSCs及巨噬细胞共培养后流式细胞术分析结果:0天各组均以M1型巨噬细胞表面标记为主,A、B、C、D组M1型细胞百分比为98.20%、99.20%、97.90%、97.20%;第1天各组表型开始变化,A、B、C、D组M1表型百分比95.20%、79%、64.20%、78.50%,其中以C组M1型细胞比例减少最为明显;第3天M1型细胞所占比例:A、B、C、D组分别为90.70%、57.20%、11.20%、55.80%,C组M1型巨噬细胞较第1天M1型比例明显减少,88%转化为M2型巨噬细胞。(5)ELISA法检测0d、1d、3d空白对照组共培养上清液中IL-12含量为:474.840±2.978pg/mL、304.415±3.747pg/m L、325.938±12.229pg/mL;hAMSCs组上清液中IL-12含量:473.709±49.485pg/mL、235.248±1.329pg/mL、183.395±11.268pg/mL;IL-10-hAMSCs组IL-12含量:413.131±37.422pg/mL、199.429±0.319pg/mL、138.084±1.491pg/mL;空质粒-hAMSCs组上清液中IL-12含量为:421.935±73.823pg/mL、246.828±11.680pg/mL、185.869±8.570pg/mL;空白对照组上清液中IL-10含量:12.265±0.271pg/mL、17.111±1.244pg/m L、30.106±1.181pg/mL;hAMSCs组上清液中IL-10含量:16.800±2.585pg/mL、35.907±2.155pg/mL、89.128±4.872pg/mL;IL-10-hAMSCs组IL-10含量:13.515±0.716pg/mL、77.906±1.849pg/mL、258.012±5.784pg/mL;空质粒-hAMSCs组上清液中IL-10含量为:13.046±1.180pg/mL、35.593±3.467pg/mL、98.469±3.056pg/mL;空白对照组上清液中Arg-1含量:0.730±0.060ng/mL、0.925±0.083ng/mL、1.137±0.037ng/mL;hAMSCs组上清液中Arg-1含量:0.783±0.033ng/mL、2.342±0.063ng/mL、4.671±0.094ng/mL;IL-10-hAMSCs组Arg-1含量:0.820±0.035ng/mL、5.112±0.191ng/mL、10.920±0.959ng/mL;空质粒-hAMSCs组上清液中Arg-1含量为:0.802±0.046ng/mL、2.588±0.372ng/mL、4.995±0.453ng/mL;结果显示上清液中Arg-1及IL-10含量随着培养时间延长含量逐渐增加,且hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组的Arg-1、IL-10表达量在1、3天相对于对照组高,IL-10-hAMSCs组相对于hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组表达量高,并且IL-10-hAMSCs组表达量升高尤为明显。IL-12表达随着共培养时间延长含量逐渐降低,hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组含量较对照组降低,IL-10-hAMSCs组的IL-12含量较hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组降低更为明显,差异有统计学意义(P0.05)。(6)取各组生长状态良好的成纤维细胞利用CCK8试剂盒进行细胞增殖速率检测,四组成纤维细胞生长曲线均呈现“S”型,IL-10-hAMSCs组成纤维细胞增殖速率明显快于其他三组,hAMSCs组和空质粒-hAMSCs组的成纤维细胞增殖速率快于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。(7)qPCR检测出TGF-β1、I型胶原、III型胶原基因相对于β-actin基因表达量,各组上清液培养的成纤维细胞,随着培养时间延长,TGF-β1、I型胶原、III型胶原mRNA相对表达量逐渐增加,同一时间点hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组TGF-β1、I型胶原、III型胶原mRNA相对表达量均高于对照组,并且IL-10-hAMSCs组相对于hAMSCs组、空质粒组相对表达量更高,差异有统计学意义(P0.05)。hAMSCs组与空质粒-hAMSCs组相比较未见明显差异(P0.05)。通过Western blot检测结果显示:在第3d和5d,hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组的TGF-β1、I型胶原、III型胶原蛋白表达量随着培养时间延长逐渐增加,同一时间点hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组TGF-β1、I型胶原、III型胶原蛋白表达量均高于空白对照组,IL-10-hAMSCs组相对于hAMSCs组、空质粒-hAMSCs组相对表达量更高,差异有统计学意义(P0.05)。hAMSCs组与空质粒-hAMSCs组相比较未见明显差异(P0.05)。结论:1.与hAMSCs相比IL-10-hAMSCs能够在体外促进巨噬细胞由促炎表型M1型向组织修复型M2型转化。2.IL-10-hAMSCs与巨噬细胞共培养上清液能够促进成纤维细胞增殖,并上调成纤维细胞TGF-β1、I型及III型胶原的表达,有利于促进创面早期愈合。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R64
【部分图文】：

示意图,小鼠腹腔巨噬细胞,共培养,示意图

37 ℃细胞培养箱中孵育 4h，4h 后每孔加入 2ml PB颗粒 3 次，显微镜下观察计数 100 个巨噬细胞，计算巨噬细胞胞浆中吞有大小墨粒 5 个以上的为阳性细胞，吞噬百分率=阳胞×100%。腔巨噬细胞与 hAMSCs 分组共培养为：A 组：空白对照组（单纯添加培养基）+小鼠腹腔巨噬细s+小鼠腹腔巨噬细胞组；C 组：IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬细hAMSCs+小鼠腹腔巨噬细胞组；小鼠腹腔巨噬细胞培养 3~4 天 M1 型，移除 6 孔板内含 IFN-γ及 LPS 的 DMEM/F12 培养基胞及培养基于 Transwell 小室上层（图 1），加入 DMEM/F12 5％CO2、37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。培养 0d后期 ELISA 指标检测，同时收集相应时间点的细胞进行后期

形态,生长特点,硕士学位论文,旋涡状

遵义医学院硕士学位论文岳凤3 结果3.1 hAMSCs 形态及生长特点原代细胞细胞接种 48h 后，hAMSCs 大部分已贴壁，形态多样，呈纺锤状多突起短梭形或多角形，排列紊乱，成纤维细胞样生长。培养至第 5～6 天时，贴壁细胞合至 90%以上。传代后 24 小时基本贴壁，大多呈长梭形，少数呈现短棒状，相互联，3~5 天细胞密度可达 80%～90%，形态呈长梭形或纺锤状，旋涡状生长，具有向性。3~5 天更新一代，随着传代次数增加，细胞生长速度逐渐变慢，部分细胞肥大内部可见空泡，且出现伪足（图 2）。

流式细胞术,间充质干细胞,表面标志,硕士学位论文