miR-146a在应激性溃疡中调控作用的研究

发布时间：2020-11-01 02:39

　　 目的:战争、恐怖袭击、自然灾害以及突发事件的爆炸伤或烧伤等外界突发强烈刺激引起机体各系统产生剧烈反应,在消化道表现为应激性溃疡,发病率和死亡率均较高;其发病机制主要涉及胃黏膜屏障作用的减弱、胃酸及炎症介质过度释放、细菌及内毒素移位、幽门螺旋杆菌感染、神经-内分泌轴失衡等方面,但其分子机制方面尚无巨大突破;有研究发现应激性溃疡的发生与NF-κB激活密切相关,但NF-kB通路如何参与的具体作用机制尚未阐明。本题组前期在幽门螺杆菌感染相关microRNAs功能研究中发现microRNA-146a作为依赖NF-κB生成的内源性调控因子,负性调控NF-κB,参与炎症应答。在应激性溃疡中miR-146a是否能调控NF-kB,以及通过何机制调控应激性溃疡还不清楚。本实验通过建立应激性溃疡体内模型和体外模型,探索应激性溃疡模型标本中microRNA-146a的是否过表达;构建并鉴定microRNA-146a的靶基因;分析microRNA-146a是否通过目的靶基因发挥负性调控作用,探讨microRNA-146a抑制应激性溃疡发生发展的作用机制。研究“应激性溃疡发生、microRNA-146a变化与抑制效应”的作用模式和机制,对进一步阐明应激性溃疡的分子发病机制具有重要意义,更为研究战时应激性溃疡的治疗和预防策略提供实验室数据支持。方法:1、体内验证模型胃黏膜组织中是否存在miR-146a的表达。采用冷水束缚模型处理小鼠,分别取实验组和对照组的胃黏膜做HE染色和Real-time PCR检测NF-κB p65、microRNA-146a 的表达。2、体外人胃腺癌AGS细胞应激性溃疡模型的建立及miR-146a在模型中的表达。采用200umol/L H2O2处理AGS细胞6 h,检测两组丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及NF-κBp65、microRNA-146a的表达。3、microRNA-146a在应激性溃疡发生机制中负性调控作用的研究。结合生物信息学库预测、双荧光素酶报告载体实验、实时定量PCR等方法鉴定miRNAs在AGS细胞中的靶基因;通过体外过表达或抑制表达miRNAs、PCR等实验深入研究miRNAs在应激性溃疡中调控炎症反应的作用机制。结果:1、体内验证模型胃黏膜组织中是否存在miR-146a的表达。100倍光学显微镜下,与对照组比较,实验组小鼠胃黏膜上皮部分呈现明显的缺损,表面有炎性渗出物,说明模型建立成功;Real-time PCR结果显示实验组microRNA-146a的mRNA表达上升了 4 倍(P0.01)、NF-κBp65 的 mRNA 表达升高了 2 倍(P0.01)。2、体外人胃腺癌AGS细胞应激性溃疡模型的建立及miR-146a在模型中的表达。与对照组比较,实验组细胞内MDA的含量明显增加(P0.01)、SOD活力下降较明显(P0.01),说明细胞模型建立稳定;microRNA-146a和NF-kBp65的mRNA表达均明显升高(P0.01,P0.01)。3、microRNA-146a在应激性溃疡发生机制中负性调控作用的研究。①microRNA-146a靶基因的预测和鉴定在TargetScan和Miranda预测到microRNA-146a 的可疑靶基因 APPL1(Adaptor protein containing PH domain,PTB domain and leucinezipper motif1),构建作用靶点荧光素酶报告载体证实microRNA-146a能与可疑靶基因APPL1 3'-UTR互补结合;Real-time PCR结果表明,micro-146a能降解靶基因APPL1的mRNA从而抑制其翻译。②microRNA-146a抑制应激性溃疡炎症反应过表达microRNA-146a后,能显著降低应激性溃疡细胞模型中炎症关键链NF-κB的表达,显著减少MDA产生以及增加SOD活性,证明miRNA-146a在应激性溃疡炎症反应中起负反馈调控作用。结论:1、应激性溃疡能够引起小鼠胃黏膜和人胃腺癌AGS细胞中microRNA-146a的表达上调,可能参与了发生发展过程。2、microRNA-146a能通过其靶基因APPL1负性调控应激性溃疡炎症反应过程。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R632.1
【部分图文】：

实验组 对照组图 1 小鼠全胃病理切片（100 倍）激性溃疡时胃黏膜 miRNAs 表达的变化索应激时胃黏膜 miR-146a 和 NF-kB p65 的表达，我们采用基因的表达，结果发现：与对照组相比，实验组 miR-146a P<0.01），NF-kB p65 的表达升高 2 倍余（P<0.01），如图 2。****0.40.50.60.70.80.91laitvexpEresismo

pMIR-REPORTTMLuciferace报告基因质粒图谱

21图 5 pRL-TK 质粒图谱-146a 靶基因的预测 应用应用 TargetScan 和 Miranda 生物miR-146a 的靶基因，选择基因片段存在有 7 个互补结合位点用靶点。素酶报告载体实验鉴定 miR-146a 的靶基因基因的构建与建立 根据生物信息学预测的靶基因 APPL1
【参考文献】

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本文编号：2864905