随着生活水平的提高,国人参加体育锻炼和竞赛的活动明显增加,随之导致的运动损伤也逐年增多。肌腱损伤是人体运动损伤的常见疾病,其中肩袖等部位的肌腱损伤是目前临床上治疗的难点。根据患者术后随访及影像学检查结果发现,修补或重建的肩袖大多数难以达到足够的力学强度,相当一部分患者存在肩袖修补失败和再次断裂的情况。肩袖损伤修复困难的原因是多方面的,其中最主要的原因是很难达到理想的腱骨愈合。腱骨愈合是决定肌腱损伤修复成功与否的关键。生理上的腱骨连接点分为间接止点与直接止点两类。间接止点通过较厚的韧带组织固定在骨膜上,其特征为穿插性的胶原纤维连接,这种纤维的走向通常与骨纵轴成角或垂直,称为sharpey纤维。直接止点则通过一渐变转化区域逐渐将肌腱锚定在骨深层,这一结构可分为四层,包括韧带组织,纤维软骨组织,钙化软骨组织及骨组织。肌腱损伤后修复重建形成直接止点需要一个漫长过程,可达数月至数年。这一修复过程因时间漫长,机制复杂往往难以顺利完成。目前,临床上大多应用自体或异体肌腱移植重建来修复肌腱损伤,肌腱移植物植入骨隧道后需经历坏死期、增殖期和韧带化期才能达到比较理想的腱骨愈合。坏死期亦称为炎症期,该过程中肌腱移植物出现坏死降解,其力学强度将显著降低,一般指移植物植入后4周内。增殖期肌腱移植物出现重塑及再血管化,在此期间移植物内细胞的数量及活性决定细胞外基质的含量及血管化程度,通常指移植物植入后4-12周。韧带化期指增殖期后至移植物重建形成理想腱骨愈合界面的漫长阶段,可根据具体情况长达数月至数年。在上述过程中,增殖期是腱骨愈合修复的关键,肌腱移植物能否在这一时期内及时重塑及充分血管化很大程度上决定了韧带化期能否达到理想的腱骨愈合。然而,目前临床上广泛应用的自体或异体肌腱内部组织致密,间隙狭小,难以满足早期细胞快速长入的需求。肌腱移植物在坏死期过后往往因细胞含量不足很难进行及时有效地增殖重塑和血管化,从而导致腱骨愈合后期修复延迟甚至失败。近年来,应用组织工程技术修复腱骨愈合逐渐成为研究热点。鉴于人体肌腱韧带组织需要承受关节运动时强大的负荷,在肌腱损伤的组织工程中,我们需要通过置入支架材料来满足损伤肌腱早期康复锻炼所需的力学强度,并通过有效募集、粘附周围组织细胞,促进其长入、增殖并产生细胞生长因子来加速损伤肌腱的再生。蚕丝作为一种生物相容性好,力学性能强和降解缓慢的纤维蛋白,在肌腱、韧带组织工程中的应用日益深入。Altman、Sahoo等研究了蚕丝支架用于肌腱重建,发现其力学强度可靠,能获得较好的前中期效果。但他们同时发现,蚕丝支架内部孔隙很小,阻碍了新生组织的长入,后期不能在支架内形成相互连接、有功能的修复组织。把蚕丝进行一定程度的编织可有效增加内部的孔隙,但编织蚕丝在承担较大拉力时其内部孔隙会大大减小。最近,本研究成员把编织状的蚕丝和胶原海绵复合,构建出了一个较单纯蚕丝支架更加实用的肌腱、韧带组织工程支架。其中,胶原海绵可提供修复周围组织细胞粘附和长入的必要空间,编织状蚕丝纤维可提供足够的力学强度。此支架在一些肌腱、韧带损伤的修复中改善了修复组织的结构和功能,表现出了良好的效果。然而,由于肌腱止点腱骨界面特殊的分层结构,我们认为该胶原-蚕丝支架的空间拓扑结构对腱骨愈合的修复效果影响甚大。目前,国内外尚无相关报道。基于上述情况,本研究分别制作了平行、紊乱两种不同空间拓扑结构的胶原支架及胶原-蚕丝复合支架,通过体内、体外实验研究它们对腱骨愈合修复的影响,为该支架应用于临床提供理论依据。我们的研究主要分成三个部分,分别为:(1)支架的制作、检测,新西兰兔骨髓间充质干细胞(RBMSCs)的培养、鉴定和三系分化;(2)比较平行及紊乱的胶原支架对RBMSCs细胞形态、增殖、迁移的影响及成腱、成骨表达的作用;(3)比较平行及紊乱的胶原-蚕丝支架对家兔肩袖腱骨愈合的修复作用。第一部分支架的制作、检测,新西兰兔骨髓间充质干细胞(RBMSCs)的培养、鉴定和三系分化目的:制作胶原支架、胶原-蚕丝支架,检测其孔隙、力学等基本特性;原代提取、培养RBMSCs,流式细胞仪鉴定细胞表型,三系分化评估其干细胞潜能。方法:在无菌条件下剥取猪腿肌腱,冲洗之后用蛋白酶酶解,充分酶解后通过离心、过滤、盐析、再离心、醋酸溶解、胶原透析等步骤获取单纯的胶原。编织蚕丝购自Zhejiang Cathaya International Co.Ltd公司。将1%(w/v)胶原溶液置于亚克力模具中,利用液氮作为冻源,通过常规、单向冰冻技术获得平行、紊乱胶原半成品,再通过冻干、热交联等一系列步骤即获得平行、紊乱的胶原支架。冰冻前事先将编织蚕丝置于胶原溶液中,类似方法操作可获得平行、紊乱的胶原-蚕丝支架。大体、镜下观察支架形态,制作不同胶原含量的支架(6mg/ml、10mg/ml、18mg/ml胶原浓度)。扫描电镜评估支架内部孔隙大小。将支架植入家兔皮下2周后,评估支架内部孔隙塌陷及细胞长入情况,从而获得最适合细胞长入且支架空间拓扑结构相对稳定的胶原浓度。力学检测评估平行、紊乱的胶原支架、胶原-蚕丝支架的最大拉力,与正常家兔肩袖的力学性能进行比较。取雌性3月龄新西兰兔股骨髓腔内红骨髓原代提取RBMSCs,培养后传代、冻存。利用流式细胞仪技术对提取的细胞进行鉴定。诱导RBMSCs进行成骨、成软骨、成脂肪分化,分别用茜素红染色、阿利新蓝染色和油红染色观察矿化钙沉积、软骨颗粒和脂肪微粒,评估RBMSCs的多向分化潜能。结果:平行的胶原支架呈现出光滑亮白的外观,与肌腱相似,相比之下,紊乱的胶原支架如同海绵状,表面相对粗糙,类似于松质骨。平行的胶原支架其胶原纤维呈平行排列,而紊乱的胶原支架其胶原纤维为不规则排列。在相同胶原溶液浓度下,平行的胶原支架孔隙比紊乱的胶原支架孔隙略小。1Omg/ml的胶原支架空间拓扑结构稳定,相比6mg/ml和18mg/ml的胶原支架有更多的细胞长入。胶原纤维和网状蚕丝能紧密结合在一起,平行、紊乱的胶原-蚕丝支架力学性能未见明显差异,可胜任正常兔子肩袖的力学强度。对RBMSCs进行成骨诱导,茜素红染色可见红色矿化钙沉积。对RBMSCs进行成软骨诱导后,阿利新蓝染色可见蓝绿色软骨颗粒。对RBMSCs进行成脂肪诱导,油红染色后可见红色的脂肪微粒。结论:平行、紊乱的胶原支架及胶原-蚕丝支架可顺利制作。10mg/ml的胶原浓度制作的支架细胞孔隙较大且空间拓扑结构不易塌陷。平行、紊乱的胶原-蚕丝支架的力学性能主要取决于网状蚕丝。原代提取、培养的RBMSCs具备成骨、成软骨、成脂肪等多向分化潜能,其干细胞特性随传代次数逐渐降低。第二部分比较平行及紊乱的胶原支架对RBMSCs细胞形态、增殖、迁移的影响及成腱、成骨表达的作用目的:比较平行及紊乱胶原支架与RBMSCs的生物相容性,观察其对RBMSCs细胞形态、迁移的影响,评估其能否促进RBMSCs成腱、成骨。方法:将RBMSCs种植于平行、紊乱的胶原支架上,培养1天、3天、5天和7天。通过CCK-8试剂盒检测RBMSCs在支架中的生长曲线,评估RBMSCs与不同空间拓扑结构胶原支架的生物相容性。RBMSCs培养3天后,通过光镜、扫描电镜观察平行、紊乱的胶原支架对RBMSCs形态学的影响。将平行、紊乱的胶原支架制成1cm×1cm大小,RBMSCs形成的pellet细胞球种植于支架中心,培养3天后扫描电镜观察胶原支架上RBMSCs的迁移情况。对RBMSCs进行成腱、成骨诱导1周、2周后,利用RT-PCR检测其成腱(ColⅠ、ColⅢ及TNC)、成骨(ColⅠ、RUNX-2及BMP-2)基因表达的差别,利用Western blotting检测其成腱(ColⅢ及TNC)、成骨(RUNX-2及BMP-2)蛋白表达的差别。结果:通过CCK-8检测发现,RBMSCs在平行、紊乱的胶原支架上生长均良好,两者比较未见显著性差异。镜下观察,平行的胶原支架中RBMSCs形态多呈长梭状,细胞长轴与胶原纤维的走形平行,紊乱的胶原支架中RBMSCs形态多为不规则,细胞分布无序。扫描电镜观察pellet细胞球中RBMSCs的迁移发现,RBMSCs在平行的胶原支架上主要沿胶原纤维方向迁移,在紊乱的胶原支架上则呈放射状迁移。RT-PCR检测发现:对RBMSCs进行成腱诱导后,平行的胶原支架组RBMSCs表达ColⅠ、COlⅢ及TNC基因高于紊乱的胶原支架组;进行成骨诱导后,紊乱的胶原支架组RBMSCs表达Col Ⅰ、RUNX-2及BMP-2基因高于平行的胶原支架组。Western blotting检测发现:对RBMSCs进行成腱诱导后,平行的胶原支架组RBMSCs表达ColⅢ及TNC蛋白高于紊乱的胶原支架组;进行成骨诱导后,紊乱的胶原支架组RBMSCs表达RUNX-2及BMP-2蛋白高于平行的胶原支架组。结论:平行、紊乱的胶原支架与RBMSCs生物相容性均良好。胶原支架的空间拓扑结构对细胞增殖影响不大,对RBMSCs的形态变化和迁移影响明显。RBMSCs在平行的胶原支架中倾向于成腱表达,在紊乱的胶原支架中倾向于成骨表达。第三部分比较平行及紊乱的胶原-蚕丝支架对家兔肩袖腱骨愈合的修复作用目的:评估平行及紊乱的胶原-蚕丝支架对家兔肩袖腱骨愈合的修复效果。方法:20只雌性4月龄新西兰兔随机分为平行的胶原-蚕丝支架组及紊乱的胶原-蚕丝支架组。每组设8周、12周两个时间点,每个时间点5只兔子。创建兔子肩袖损伤及修复模型,支架近端通过骨髓道与冈上肌断端相连接,远端通过蚕丝纤维固定于骨隧道出口。在术后8周、12周收集肩袖样本,通过组织学HE、Safirain-O染色、免疫组化、胶原含量测定、力学检测等评估平行及紊乱的胶原-蚕丝支架对家兔肩袖腱骨愈合的修复效果。结果:组织学HE、Safrain-O染色及免疫组化证实:紊乱的胶原-蚕丝支架组样本的新生组织较平行胶原-蚕丝支架组的新生组织明显致密,后期(术后12周)可见大片软骨样组织。力学检测发现:紊乱的胶原-蚕丝支架组样本的最大拉力大于平行的胶原-蚕丝支架组。胶原含量测定发现:紊乱的胶原-蚕丝支架组样本的胶原含量多于平行的胶原-蚕丝支架组,且随时间延长上述差距变得更加显著。结论:与平行的胶原-蚕丝支架相比,紊乱的胶原-蚕丝支架更有助于腱骨愈合骨髓道壁细胞的粘附迁移,并诱导支架内的细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞,从而在移植物与骨髓道交界面形成更多新生组织。体内实验的研究结果表明,与平行的胶原-蚕丝支架相比,紊乱的胶原-蚕丝支架在腱骨愈合修复方面更有优势。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R687.2
【部分图文】：
胶原支架皮下异位种植??只雌性４月龄新西兰兔，１０°／。水合氯醛按照０．３ｍｌ／１００ｇ体重比例醉；??备皮后，将兔子固定在无菌手术台上，手术部位常规消毒，铺巾；??取背部正中纵行切口长约１０ｃｍ，血管钳将皮肤向两侧钝性分离，期间将不同肢原浓度ｌｃｍｘｌｃｍ支架植入皮肤与皮下组织间隙，用缝线，从头侧至尾侧排列依次为６ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ胶原浓度，胶原支架，右侧为平行的胶原支架，做好标记；??生理盐水冲洗，消毒，缝皮；??兔子分笼飼养，自由活动，标准动物饲料喂养，洁净饮水；??２周后，取出兔子体内胶原支架，进行组织学评估。??
图１－４支架力学检测??ＢＭＳＣｓ分离和培养??菌条件下，抽取雌性３月龄新西兰兔股骨髓腔内红骨髓约５ｍｌ，中；??量ＰＢＳ浸泡后，将红骨髓置入离心机中，转速１２００转／分钟，清液，再次用ＰＢＳ浸泡洗涤后离心，共２次；??去上清液，加入ＢＭＳＣｓ培养基（１．２．３配置：低糖ＤＭＥＭ、１１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００Ｕ／ｍｌ链霉素），吹打，重悬，种植、５％Ｃ０２细胞培养箱内培养；??小时后予以换液，弃去悬浮细胞，每隔７２小时换液一次；??
图１－５镜下ＲＢＭＳＣｓ细胞形态??
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