二氢硫辛酸在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及相关机制研究

发布时间：2020-11-04 21:39

　　 研究背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种常见的神经急危重症,具有高致死率和高致残率。早期脑损伤(early brain injury,EBI),即SAH后最初的72小时内发生的脑损伤,是造成SAH患者急性期死亡和后期神经功能障碍的重要因素。其病理生理机制复杂,炎症反应在其中发挥了重要的作用。近来的研究表明 NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains containing protein 3,)炎性小体在EBI的炎性反应中发挥了重要作用。二氢硫辛酸(dihydrolipoicacid,DHLA)是一种有效的抗氧化分子,它能稳定溶酶体膜,减轻氧化应激反应。在一些神经系统疾病模型,包括SAH模型中已经证实,DHLA具有神经保护功能。然而DHLA的神经保护功能的机制尚不明确。在本项研究中,我们探究DHLA对溶酶体破裂和NLRP3炎性小体激活的作用,并探究其中的信号通路。研究方法:建立大鼠SAH血管内穿刺模型,术后1小时腹腔注射DHLA,术前48小时脑室内注射溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)小干扰RNA、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)小干扰RNA。通过SAH出血量评分,改良Garcia评分,平衡木实验,水迷宫实验,Rotarod实验来评估大鼠SAH后短期和长期神经功能。应用Western blot技术测定LAMP1、CaMKⅡ、转化生长因子激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)、c-JunN-末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)、NLRP3、cleaved caspase-1、白细胞介素(interleukin,IL)-1β等相关蛋白的表达,用共聚焦显微镜观察免疫荧光下相关蛋白和神经细胞的共染。结果:SAH后LAMP1的表达降低,在24小时达到最低水平。磷酸化的CaMKⅡα(p-CaMKⅡα)在SAH后表达增加,在24小时达到高峰。LAMP1与CaMKⅡα都能在神经元和小胶质细胞上表达。DHLA治疗增加了 LAMP1的表达,降低了p-CaMKⅡa的表达,并缓解了 SAH后短期以及长期的神经功能损害。LAMP1小干扰RNA破坏了 DHLA的神经功能保护作用,并且增加了 p-CaMKⅡα、p-TAK1、p-J-NK和NLRP3炎性小体的表达。CaMKⅡα小干扰RNA下调了 p-TAK1、p-JNK和NLRP3炎性小体的表达并改善了 SAH后的神经功能。结论:DHLA治疗能通过LAMP1/CaMKⅡ/TAK1信号通路减轻SAH后早期脑损伤的炎症损伤,改善神经功能。DHLA也许能为缓解SAH后早期脑损伤提供一种有前景的治疗方法。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.35;R651.15
【部分图文】：

ＮＬＲＰ３的表达增加；（２）?ＤＨＬＡ可以稳定溶酶体膜，增加ＬＡＭＰ１表迖，降低??ＣａＭＫＩＩ及ＮＬＲＰ３炎性小体的表达，并改善神经功能；（３）?ＤＨＬＡ的抗炎性作用??通过ＬＡＭＰｌ／ＣａＭＫＩＩ／ＴＡＫｌ信号通路的调控（图１．１）。??Ｓ?ＳＡＨ??—ｖ?：????溶酶体破裂?Ｃ：??ＬＡＭＰ１?＜——二氢硫辛酸（ＤＨＬＡ）??丄??＼?ＣａＭＫＩＩ??Ｉ??Ｐ??ＴＡＫ１?｜｜?Ｐｒｏ－ＩＬ－ｌｐ??ｆ?？?ｆ?Ｆｒｏ－ＩＬ－１８?????Ｐ＇?ＪＮＫ??＞?＾?炎性反应??、ＩＬ－１Ｐ????，?ＩＬ－１８??＜?促进?Ｃａｓｐａｓｅｌ??１?抑制?ＮＬＲＰ３炎性小体??图１．１二氢硫辛酸在蛛网膜下腔出血后稳定溶酶体膜，抑制炎性反应的机??制。??３??

图１．２?Ｓｕｇａｗａｒａ?ＳＡＨ出血评分法［ｕ〗。??．４神经功能评分??神经功能评分是采用双盲的方法。采用改良的神经功能缺损评分（Ｇａｃｉａ评分）??实验动物２４小时后神经功能缺损状况［１１］。改良的Ｇａｃｉａ评分包括自主运动、??活动、前肢伸展、攀爬活动、本体感觉和触须刺激六项，评分范围０？３??总分为３？１８分（表Ｕ）。??

第一部分实验共使用大鼠４４只，ｓｈａｍ组６只，ＳＡＨ组３８只。其中ｓｈａｍ组??死亡０只，ＳＡＨ组死亡５只，死亡率为１３．２％。因ＳＡＨ评分低于９分，排除１??只。各ＳＡＨ组的ＳＡＨ评分没有显著差异，提示模型制作稳定（图１．３）。??ｗ??Ｓｈａｍ?ＳＡＨ??Ｂ?Ｃ?１８??Ｇｒｏｕｐｓ?Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ?Ｅｘｃｌｕｄｅｄ?１５＇?〇９?°??Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ?１?１２?Ｈ９?ＲＨ??－?°，６?。?Ｌ??ＳＡＨ?（３ｈ；?６ｈ，?１２ｈ，?２４ｈ，?７２ｈ）?５／３８?１?３＇誦?＿?■?＿?＿??Ｔｏｔ＾?５／４４?１?〇?Ｓｈａｍ?３ｈ?６ｈ?１２ｈ?２４ｈ?７２ｈ??ＳＡＨ??图１．３实验用鼠的分组、死亡率和ＳＡＨ评分。Ａ：典型的ｓｈａｍ组和ＳＡＨ组??模型图片；Ｂ：各组实验用鼠的死亡率和排除率；Ｃ：各组的ＳＡＨ评分。Ｂａｒｓ代??表?ｍｅａｎ士ＳＥＭ；?ｎ＝６〇??１．３．２?ＳＡＨ后ＬＡＭＰ１的表迗及与神经细胞的共定位情况??我们用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ实验测定ＳＡＨ后３、６、１２、２４和７２小时ＬＡＭＰ１蛋白??的表达水平。结果显示：ＳＡＨ后３小时ＬＡＭＰ１表达开始降低，到２４小时表达迖??到最低水平，７２小时后开始回升。其中２４小时后的表达跟ｓｈａｍ组比有统计学差??异（Ｐ＜０．０５?图?１．４）。??１８??
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本文编号：2870640