MiR-21调节树突状细胞对创面愈合的影响及其相关机制的研究

发布时间：2020-11-08 21:26

　　 皮肤是保护人体免受外界刺激、外界损伤的第一道屏障,临床上由各种急、慢性致伤因素导致的皮肤损伤十分常见。皮肤创面的愈合是一个复杂的动态过程,主要涉及炎症、增殖和重塑三个重叠阶段,严重创伤愈合后往往导致局部组织胶原过度沉积和纤维化,形成增生性瘢痕,严重影响患者的心理健康和生理功能,因此各种创伤所致的创面修复仍是一个严峻的医学和社会问题。近年来,一类在转录后水平调控蛋白表达参与多种生物学功能的小非编码RNA—microRNA被发现,它们在创面愈合中的调控作用也被逐渐发现和重视。大量研究发现,皮肤创面愈合过程中多种miRNAs差异表达,某些miRNAs参与了创面愈合中炎症、增殖、重塑三个复杂动态修复过程。据研究报道,miR-203和miR-210可通过介导角质形成细胞增殖和迁移进而诱导创面愈合,而miR-99和miR-200家族则可通过抑制角质形成细胞迁移来抑制创面愈合。其他研究还发现,与肿瘤发生发展密切相关的癌症相关miRNA—miR-21在皮肤创伤组织中表达水平显著上调,抑制miR-21表达可显著抑制创面愈合和胶原沉积,而过表达miR-21则促进了创面愈合。同时,大量研究已证实miR-21在肺、肾和肝脏等多种组织脏器中具有促进组织纤维化作用,且在增生性皮肤瘢痕中也呈高表达状态,表明miR-21可能是一种创伤后促进创面愈合的应激保护分子。此外,已有研究证实,miR-21也能够调节外周血中树突状细胞(dendritic cells,DCs)的分化和功能,而树突状细胞在伤口修复中也起着非常重要的作用,增加DCs的数量可显著促进创面的愈合,而减少DCs的数量则表现为创面愈合延迟。因此,我们推测:创面组织中过表达miR-21会不会通过增加创伤组织中DCs含量进而促进创面愈合?本研究拟采用过表达miR-21模拟物或抑制剂的慢病毒感染SD大鼠皮肤创面组织来调控创面局部miR-21表达水平,在体内观察miR-21对创面组织中DCs细胞含量、创面愈合及相关指标和信号通路PTEN/PI3K/AKT的影响,并通过体外细胞模型进一步研究进行验证miR-21对DCs分化和角质形成细胞迁移的影响,以探讨miR-21在创面愈合中的作用及潜在分子作用机制。第一部分大鼠创面组织中miR-21及相关指标的表达研究方法取25只清洁级雄性SD大鼠室内适应饲养7d,经腹腔注射1%戊巴比妥钠(350 mg/kg)对其进行麻醉,然后固定于手术台上,对背部7 cm×3 cm大小区域进行脱毛处理,碘伏酒精消毒后,用无菌手术刀制作4 cm~2的全层皮肤缺损创面,全层切开皮肤,开放创面,深达肌肉,充分止血,创面以无菌纱布覆盖,外用医用胶布固定,自由进食饮水。于造模后即刻、第6h、24h、48h、72h随机抽取5只SD大鼠,取各大鼠创面渗出液,检测其细胞含量,并取创面组织进行分子生物学相关检测。结果创面损伤模型建立后,分别于0h、6h、24h、48h、72h时检测创伤组织中miR-21表达,发现miR-21表达均显著上调,且于24h时表达达到最大值;基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9,MMP-9)的表达与miR-21趋势相同,在创伤形成后6h内显著增加,并于24h达到最大值。伤口形成后72h内,伤口渗出液中细胞总数也明显增加,同时CD11c+CD209+DCs的含量也随之显著增加。进一步分析表明,miR-21的表达与MMP-9的表达呈显著正相关(r=0.9027),同样也与CD11c+CD209+DCs的含量呈显著正相关(r=0.9348)。Western blot检测发现,伤口形成后72h内,第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)蛋白表达显著降低,磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B,p-Akt)p-AKT蛋白表达显著增加,而总的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)无明显变化。结论创伤形成后,创面组织中miR-21、MMP-9、p-AKT表达以及创面渗出液中细胞总数和CD11c+CD209+DCs含量均显著增加,并于24h时均达到最大值,而创伤组织中PTEN表达显著降低,并于24h时达到最小值。MiR-21的表达与MMP-9的表达和CD11c+CD209+DCs的含量呈显著正相关。第二部分MiR-21对皮肤创面愈合的影响研究方法将过表达和抑制miR-21表达的慢病毒载体(LV-miR-21 mimic和LV-miR-21 inhibitor)与包装质粒转染至293T细胞中包装慢病毒。取160只清洁级雄性SD大鼠,按照第一部分方法制备创面损伤SD大鼠模型,并随机分为4组:control组、LV-NC组、LV-miR-21 mimic组和LV-miR-21 inhibitor组,每组40只,其中control组创面局部注射5μl生理盐水,其他各组分别注射对应的慢病毒5μl。造模后分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天,利用透明薄膜覆盖大鼠创面,数码相机拍照后用图像分析软件Image-proplus6.0对创面面积进行统计分析处理,计算公式为:创面残留率=残余创面面积/原始创面面积×100%;qRT-PCR检测创面组织中miR-21和PTEN mRNA变化;流式细胞仪检测创口渗出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot检测创面组织中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表达水平。结果与control组和LV-NC组相比,LV-miR-21 mimic组创伤组织中miR-21的表达明显上调,而LV-miR-21 inhibitor组中miR-21表达则显著被抑制。与control组相比,LV-miR-21 mimic能够明显改善大鼠皮肤创面愈合,而LV-miR-21inhibitor则显著延缓创面愈合进程。CD11c+CD209+DCs的含量随miR-21表达的增加而增加,随miR-21表达的降低而降低。创伤形成后3天,LV-miR-21 mimic可在mRNA和蛋白水平上抑制PTEN的表达,相反LV-miR-21 inhibitor则可促进PTEN mRNA和蛋白的表达。过表达miR-21也可在蛋白水平上显著上调p-AKT和MMP-9的表达;相比之下,抑制miR-21则可使p-AKT和MMP-9的蛋白表达明显降低。结论过表达miR-21能够明显缩短大鼠皮肤创面的愈合时间,诱导创面组织中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表达增加,抑制创面组织中PTEN表达;相反,抑制miR-21则可显著延缓创面愈合进程,降低创面组织中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表达,促进创面组织中PTEN表达。上述结果表明,增加miR-21的表达可促进皮肤创面的愈合,反之则会延缓创面的愈合。第三部分MiR-21通过改变DCs含量影响创面的愈合研究方法取60只清洁级雄性SD大鼠,按照第一部分方法制备创面损伤SD大鼠模型,并随机分为4组:control组、FL(fms-like tyrosine kinase-3 ligand,FMS样酪氨酸激酶-3配体)组、LV-miR-21 inhibitor组和LV-miR-21 inhibitor+FL组,每组15只,其中control组创面局部注射5μl生理盐水,LV-miR-21 inhibitor组和LV-miR-21 inhibitor+FL组创面局部注射LV-miR-21 inhibitor慢病毒5μl,FL组和LV-miR-21 inhibitor+FL组于创伤部位周围真皮组织注射FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)来刺激DCs分化,每日注射10μg,连续注射4天。造模后分别于第1、3、5天,利用透明薄膜覆盖大鼠创面,数码相机拍照后用图像分析软件Image-proplus6.0对创面面积进行统计分析处理,计算公式为:创面残留率=残余创面面积/原始创面面积×100%;qRT-PCR检测创面组织中miR-21和PTEN mRNA变化;流式细胞仪检测创口渗出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot检测创面组织中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表达水平。结果创面形成后1、3、5天分别检测创面残留率,发现LV-miR-21 inhibitor组创面愈合明显减缓,而应用FL组则显著促进皮肤创面的愈合,并逆转LV-miR-21inhibitor对伤口愈合的抑制作用。应用FL可诱导创面组织中CD11c+CD209+DCs含量增加,并促进miR-21、p-AKT和MMP-9的表达以及抑制PTEN的表达。此外,LV-miR-21 inhibitor对CD11c+CD209+DCs含量及miR-21、p-AKT、MMP-9、PTEN表达的影响可被FL部分逆转。结论MiR-21 inhibitor显著延缓了创面愈合,降低了创面渗出液中DCs含量,抑制了p-AKT、MMP-9表达及促进PTEN表达,而FL则逆转了miR-21 inhibitor的作用,表明miR-21可能通过增加创面组织中DCs的含量促进创面愈合。第四部分MiR-21对DCs分化的影响研究方法用淋巴细胞分离液分离大鼠外周血单个核细胞(PBMCs),将分离得到的PBMCs在含有10%FBS和1%链霉素青霉素的RPMI 1640培养基中,置于37°C、5%CO_2的加湿保温细胞培养箱中培养。将miR-21模拟物/抑制剂或miR-NC转染至PBMCs中,后用重组大鼠GM-CSF和IL-4诱导培养5天。流式细胞仪检测诱导后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;qRT-PCR检测PBMCs中miR-21、PTEN和MMP9的表达变化;ELISA法检测PBMCs上清液中MMP-9的分泌;Western blot检测PTEN、p-AKT、AKT和MMP-9蛋白表达。结果过表达miR-21显著促进了PBMCs中DCs的分化,而miR-21 inhibitor抑制了DCs的分化。另外miR-21 inhibitor显著上调PTEN mRNA和蛋白表达,而过表达miR-21则明显抑制了PTEN的表达。MiR-21 inhibitor可抑制MMP-9的分泌和p-AKT表达,miR-21模拟物的作用则与之相反。结论过表达miR-21能够促进PBMCs中DCs的分化,抑制PTEN表达并促进p-AKT和MPP-9的表达,诱导细胞上清培养液中MMP-9分泌增加。第五部分PTEN通过PI3K/AKT信号通路对DCs分化的影响研究方法用淋巴细胞分离液分离大鼠外周血单个核细胞(PBMCs),将分离得到的PBMCs在含有10%FBS和1%链霉素青霉素的RPMI 1640培养基中,置于37°C、5%CO_2的加湿保温细胞培养箱中培养。将PTEN干扰RNA—si-PTEN转染至PBMCs中,联合或不联合PI3K/AKT抑制剂LY 294002处理,后用重组大鼠GM-CSF和IL-4诱导培养5天。流式细胞仪检测诱导后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;ELISA实验检测PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;Western blot检测p-AKT和AKT的蛋白表达。结果PTEN基因敲除能有效地促进PBMCs中DCs的分化和MMP-9的分泌及p-AKT的蛋白表达,而PI3K/AKT抑制剂LY 294002则能明显减轻si-PTEN诱导的DCs含量、MMP-9分泌和p-AKT的蛋白表达。结论PTEN能够通过PI3K/AKT信号通路抑制PBMCs中DCs的分化和细胞上清培养液中MMP-9的分泌。第六部分MiR-21通过调节PTEN促进DCs分化进而影响角质形成细胞的迁移研究方法利用TargetScan在线生物信息学分析网站和双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PTEN之间的靶向调控关系。用淋巴细胞分离液分离大鼠外周血单个核细胞(PBMCs),将分离得到的PBMCs在含有10%FBS和1%链霉素青霉素的RPMI 1640培养基中,置于37°C、5%CO_2的加湿保温细胞培养箱中培养。将miR-21 inhibitor和/或si-PTEN转染至PBMCs中,用GM-CSF和IL-4培养5d。ELISA实验检测PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;用转染PBMCs的上清液培养角质形成细胞,划痕实验检测角质形成细胞的迁移变化。结果TargetScan在线生物信息学分析显示miR-21和PTEN中存在互补结合的核苷酸序列。双荧光素酶报告基因实验表明,转染miR-21 mimic可显著抑制PTEN的荧光素酶活性。用转染miR-21 inhibitor的细胞上清液培养角质形成细胞后细胞的迁移能力显著降低,而沉默PTEN则逆转了miR-21 inhibitor对角质形成细胞迁移的抑制作用。进一步研究证实,转染miR-21 inhibitor能够降低PBMCs上清液中MMP-9的含量,而这种下调作用可被沉默PTEN所逆转。结论MiR-21能够通过靶向调节PTEN的表达促进DCs的分化进而影响角质细胞的迁移。综上所述,miR-21对创面愈合的促进作用可能是通过抑制PTEN激活PI3K/AKT信号通路增加DCs的含量而实现的。MIR-21对创面愈合有着深远的影响,本研究为旨在通过调节miR-21增加DCs含量而促进创面愈合的新治疗策略应用提供了实验依据。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R641
【部分图文】：

法 SPSS 22.0 软件进行分析，所有数据以均数±标准差符合正态分布，两组数据比较用独立样本 t 检验，差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。结 果组织中 miR-21 的表达 可以看出，创伤模型建立后 0h、6h、24h、48h、72中 miR-21 表达，发现与 0h 相比，其他各个时间点于 24h 时达到最大值，差异显著（P<0.01）。

间点创面组织渗出液中总细胞数的变化；注：与 0h 组umber in wound fluids at different time points; **P< 0. 01group织渗出液中 CD11c+CD209+ DCs 含量变化1.3 所示，创伤模型建立后 0h、6h、24h、48h、渗出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量变化，发现组织渗出液中 CD11c+ CD209+ DCs 数量均显著进一步分析发现，创面组织中 miR-21 表达与创9+ DCs 的数量呈正相关（r=0.9348），差异具

点创面组织渗出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量变化；注**P<0.01entage of CD11c+ CD209+ DCs in wound fluids at differen0. 01, compared with 0h group组织中 MMP-9 mRNA 表达变化 1.4 所示，创伤模型建立后 0h、6h、24h、48h、中 MMP-9 mRNA 表达变化，发现与 0h 相比，其P-9 mRNA 表达均显著增加，且于 24h 时达到最织中 miR-21 表达与 MMP-9 的表达呈正相关(r=（P<0.05）。
【参考文献】

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本文编号：2875368