趋化因子受体CXCR3和血红素加氧酶-1基因联合修饰的骨髓间充质干细胞保护移植小肠的作用及其机制研究
发布时间：2020-11-09 14:11
目的:探讨趋化因子受体CXCR3(CXC subfamily chemokine receptor 3,CXCR3)和血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)基因联合修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在减轻小肠移植排斥反应和修复移植小肠功能的作用及其作用机制。方法:1.采用SPF级的健康的雄性Lewis大鼠,提取股骨和胫骨骨髓,使用全骨髓贴壁筛选法制备BMMSCs,并通过对BMMSCs的生长形态、分化能力和表面标记进行鉴定。2.将载有不同目的基因的腺病毒转导进BMMSCs,制备腺病毒空载的BMMSCs(Ad/BMMSCs)、载有HO-1基因的BMMSCs(Ad-HO-1/BMMSCs)、载有CXCR3基因的BMMSCs(Ad-CXCR3/BMMSCs)和载有CXCR3以及HO-1基因的BMMSCs(Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs)。3.使用TNF-α处理大鼠肠上皮细胞(IEC-6),制备肠上皮损伤模型;将损伤的IEC-6细胞与不同的BMMSCs以及正常淋巴细胞共同培养;通过结晶紫染色法和活细胞工作站法检测不同BMMSCs的趋化能力,Western blot、RT-PCR和免疫组化技术检测p38-MAPK通路的相关分子的表达情况,细胞流式术和ELISA方法检测T淋巴细胞活性。4.以Brown Norway大鼠为实验供体,Lewis大鼠为实验受体,建立异位大鼠小肠移植排斥反应模型。术前给予预处理,在术后0 h、1 d、3 d、7 d、10 d和14 d搜集各组的标本。观察大鼠的生存状态以及生存时间并做生存率分析。通过苏木素-伊红染色分析肠道的排斥和损伤情况,Western blot、RT-PCR和免疫组化技术检测小肠组织中HO-1、CXCR3以及p38-MAPK通路的相关分子的表达情况,基因芯片筛选差异基因。通过细胞流式术检测脾脏调节性T淋巴细胞的水平,乳酸脱氢酶法检测全血NK细胞活性,ELISA方法检测各组血清中促炎和抗炎因子以及二胺氧化酶的含量。结果:1.采用全骨髓贴壁筛选法可以成功获得BMMSCs。获得的Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs生物学特性与BMMSCs相比均未有改变。2.IEC-6能够在体外成功建立肠道细胞损伤模型;以BN大鼠为供体,Lewis大鼠为受体能够建立稳定的小肠移植急性排斥反应模型。3.基因芯片筛选出的差异基因与p38-MAPK信号通路相关。4.Western blot、RT-PCR和免疫组化技术检测可发现BMMSCs能够抑制受损细胞的p38-MAPK蛋白的磷酸化,使得p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化被抑制,凋亡减少,PCNA和ZO-1的表达增加。其中Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs的作用最显著,且有CXCR3修饰的BMMSCs降低T淋巴细胞活性更明显。5.在异基因异位小肠移植排斥反应模型中,给以CXCR3和HO-1基因联合修饰的BMMSCs治疗能够更明显的延长受体大鼠的生存时间;且能够更明显的降低促炎因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ和TNF-α含量,减轻肠上皮细胞的凋亡,降低NK细胞活性,增加抗炎因子IL-10和TGF-β的含量,并增加调节性T淋巴细胞的水平。对移植术后7 d各组移植肠道的组织分析发现,CXCR3和HO-1基因联合修饰的BMMSCs能够更明显的抑制p38-MAPK蛋白的磷酸化和p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化,而更明显的促进PCNA和ZO-1的表达。结论:全骨髓贴壁筛选法能够成功培养出符合实验需要的BMMSCs。以腺病毒携带不同目的基因转染BMMSCs的方法是可行的。CXCR3和HO-1基因联合修饰的BMMSCs比HO-1基因联合修饰的BMMSCs和BMMSCs能更明显的延缓急性排斥反应的发生、修复受损的肠道的结构和功能及延长受体的生存时间。同时发现p38-MAPK信号通路参与了此保护作用。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R656.7
【部分图文】：
图 1-1. BMMSCs 的形态学特征（100×）A：原代干细胞贴壁后的形态（72h）；B：二代干细胞；C：三代干细胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的体外分化结果第 3 代状态良好的 BMMSCs 成骨诱导分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色试剂盒染色后发现，进行成骨诱导的 BMMSCs 胞质中有大量的黑色团块状物质沉积，有的呈现小的黑色颗粒状，此为阳性表现，其余胞质为粉色，胞核为红色（图1-2 B）；而未进行诱导的 BMMSCs 胞质没有出现黑色物质沉积（图 1-2 A）；证实 BMMSCs 能够诱导为成骨细胞。BMMSCs 成脂诱导分化 7 d 后，未进行油红O 染色前，显微镜下可见胞质中有透明的滴状物质，进行油红 O 染色后可见透明的滴状物质被染成橘红色，此为脂滴（图 1-2 C）；而未诱导的 BMMSCs 胞质中没有出现橘红色脂滴（图 1-2 A）。提示，体外提取到的 BMMSCs 能够成功诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞，BMMSCs 具有多向分化潜能。
图 1-1. BMMSCs 的形态学特征（100×）A：原代干细胞贴壁后的形态（72h）；B：二代干细胞；C：三代干细胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的体外分化结果第 3 代状态良好的 BMMSCs 成骨诱导分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色试剂盒染色后发现，进行成骨诱导的 BMMSCs 胞质中有大量的黑色团块状物质沉积，有的呈现小的黑色颗粒状，此为阳性表现，其余胞质为粉色，胞核为红色（图1-2 B）；而未进行诱导的 BMMSCs 胞质没有出现黑色物质沉积（图 1-2 A）；证实 BMMSCs 能够诱导为成骨细胞。BMMSCs 成脂诱导分化 7 d 后，未进行油红O 染色前，显微镜下可见胞质中有透明的滴状物质，进行油红 O 染色后可见透明的滴状物质被染成橘红色，此为脂滴（图 1-2 C）；而未诱导的 BMMSCs 胞质中没有出现橘红色脂滴（图 1-2 A）。提示，体外提取到的 BMMSCs 能够成功诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞，BMMSCs 具有多向分化潜能。
天津医科大学博士学位论文 一、BMMSCs 的提取及基因转染 BMMSCs 的制备细胞流式术检测显示：第 3 代 BMMSCs 中有 99.8 %的 BMMSCs 表达表面分子 CD29，99.6 %的 BMMSCs 表达表面分子 CD90，100 %的 BMMSCs 表达 MHCⅠ类抗原 RT1A，而所有的 BMMSCs 基本不表达 CD34、CD45 和 RT1B（MHCⅡ类抗原）（图 1-3）。
【参考文献】
本文编号：2876542
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R656.7
【部分图文】：
图 1-1. BMMSCs 的形态学特征（100×）A：原代干细胞贴壁后的形态（72h）；B：二代干细胞；C：三代干细胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的体外分化结果第 3 代状态良好的 BMMSCs 成骨诱导分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色试剂盒染色后发现，进行成骨诱导的 BMMSCs 胞质中有大量的黑色团块状物质沉积，有的呈现小的黑色颗粒状，此为阳性表现，其余胞质为粉色，胞核为红色（图1-2 B）；而未进行诱导的 BMMSCs 胞质没有出现黑色物质沉积（图 1-2 A）；证实 BMMSCs 能够诱导为成骨细胞。BMMSCs 成脂诱导分化 7 d 后，未进行油红O 染色前，显微镜下可见胞质中有透明的滴状物质，进行油红 O 染色后可见透明的滴状物质被染成橘红色，此为脂滴（图 1-2 C）；而未诱导的 BMMSCs 胞质中没有出现橘红色脂滴（图 1-2 A）。提示，体外提取到的 BMMSCs 能够成功诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞，BMMSCs 具有多向分化潜能。
图 1-1. BMMSCs 的形态学特征（100×）A：原代干细胞贴壁后的形态（72h）；B：二代干细胞；C：三代干细胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的体外分化结果第 3 代状态良好的 BMMSCs 成骨诱导分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色试剂盒染色后发现，进行成骨诱导的 BMMSCs 胞质中有大量的黑色团块状物质沉积，有的呈现小的黑色颗粒状，此为阳性表现，其余胞质为粉色，胞核为红色（图1-2 B）；而未进行诱导的 BMMSCs 胞质没有出现黑色物质沉积（图 1-2 A）；证实 BMMSCs 能够诱导为成骨细胞。BMMSCs 成脂诱导分化 7 d 后，未进行油红O 染色前，显微镜下可见胞质中有透明的滴状物质，进行油红 O 染色后可见透明的滴状物质被染成橘红色，此为脂滴（图 1-2 C）；而未诱导的 BMMSCs 胞质中没有出现橘红色脂滴（图 1-2 A）。提示，体外提取到的 BMMSCs 能够成功诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞，BMMSCs 具有多向分化潜能。
天津医科大学博士学位论文 一、BMMSCs 的提取及基因转染 BMMSCs 的制备细胞流式术检测显示：第 3 代 BMMSCs 中有 99.8 %的 BMMSCs 表达表面分子 CD29，99.6 %的 BMMSCs 表达表面分子 CD90，100 %的 BMMSCs 表达 MHCⅠ类抗原 RT1A，而所有的 BMMSCs 基本不表达 CD34、CD45 和 RT1B（MHCⅡ类抗原）（图 1-3）。
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 李元新;;小肠移植的关键外科技术[J];器官移植;2012年03期
2 贾柳;侯桂英;叶明;于凯江;;1例心脏移植术后存活18年危重患者的救治体会[J];中国危重病急救医学;2011年07期
3 甘树杰;金涛;丁国善;傅志仁;;趋化因子IP10及其受体CXCR3早期诊断肝移植术后急性排异[J];同济大学学报(医学版);2007年01期
4 郑红;趋化因子及其受体的功能[J];免疫学杂志;2004年01期
本文编号：2876542
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