咪达唑仑诱导肺癌细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-11-16 00:58

　　 目的:目前,肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均高居恶性肿瘤的榜首。全世界男性中,肺癌发病率和死亡率均占全部恶性肿瘤的第一位,而女性肺癌发病率占全部恶性肿瘤的第二位,死亡率同样位于全部肿瘤的第二位。在我国,由于烟草的使用及环境因素的影响等,肺癌发病率呈显著上升趋势,我国已成为全世界肺癌大国之一;肺癌按组织学分类可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中,非小细胞肺癌是最常见的肺癌组织学类型之一,约占肺癌总数的80-85%,非小细胞肺癌可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。近些年来,无论是在我国还是全球其他国家,非小细胞肺癌的发病率亦呈逐渐增高的趋势,已成为致死率最高的恶性肿瘤类型之一。因此,探索非小细胞肺癌的有效治疗方法显得尤为重要。目前,非小细胞肺癌的治疗方式仍以手术为首选治疗方案,但是非小细胞肺癌术后复发转移的几率仍然较高,因而术后往往配合化疗、放疗等等方式,但其副作用和效果的不确定性往往影响了患者的生存期;随着“精准医学”的提出和发展,越来越多的靶向药物被人们所关注,但其靶向的单一性也成为阻碍其推广的瓶颈。因此,探索新的、靶向性广的药物就显得尤为重要。最近,科研人员逐渐发现围手术期麻醉药物的使用和麻醉技术操作或可影响到肿瘤患者的术后转归和预后。但是,究竟哪些药物或技术影响肿瘤细胞?影响效果如何?其机制又怎样?以及如何利用这些药物或技术在围手术期抑制肿瘤细胞的进一步发展和转移,确保“无瘤技术原则”已成为围手术期麻醉医师和肿瘤医师共同面临的新挑战,正逐渐成为麻醉学研究的新课题。诸多研究表明多种麻醉药物都可以影响肿瘤细胞的活性,这其中就包括咪达唑仑。咪达唑仑是γ-氨基丁酸A(GABA_A)受体激动剂,广泛用于术前镇静和作为佐剂用于神经轴向阻滞。一些研究已经表明咪达唑仑可以作为新的潜在的癌症治疗性药物,然而咪达唑仑对肺癌细胞的作用及其机制尚不清楚。本文旨在探索咪达唑仑对人非小细胞肺癌A549细胞的作用及筛选出其中的关键分子,为该药物的临床应用提供依据。方法:体外实验中,采用MTT比色法检测咪达唑仑对人非小细胞肺癌A549细胞活力的影响;死/活染色(LIVE/DEAD)联合DAPI染色观察不同浓度咪达唑仑(0、10、20μg/ml)对于A549细胞形态学的影响;流式细胞计数分析不同浓度咪达唑仑(0、10、20μg/ml)对A549细胞凋亡的影响;利用western-blot技术检测不同浓度咪达唑仑(0、10、20μg/ml)作用后凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3)的改变;信号转导和转录激活因子3(STAT3)参与多种肿瘤的发生与发展过程,为了进一步阐释咪达唑仑诱导A549细胞凋亡的机制,本研究采用western-blot技术检测不同浓度咪达唑仑作用后,A549细胞中STAT3蛋白的变化,进而利用RNA干扰技术对A549细胞进行转染STAT3 siRNA,观察转染后的细胞中STAT3蛋白的表达;再次利用MTT技术、流式细胞计数以及western-blot分别观察STAT3 siRNA转染联合咪达唑仑干预对于A549细胞活力、凋亡率以及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3)的改变和对STAT3蛋白的影响;此外,本研究利用生物信息学预测STAT3为miRNA-520d的靶基因;将miRNA-520d mimic与miRNA-520d inhibitor分别转染A549细胞后,观察STAT3蛋白的改变;双荧光素酶检测报告系统(Dual-Luciferase Assay)验证miRNA-520d通过结合在STAT3的3'UTR位调节其表达;在以上研究基础上,将miRNA-520d mimic、miRNA-520d inhibitor以及咪达唑仑联合作用于A549细胞,利用MTT比色法检测、流式细胞计数以及western-blot分别观察A549细胞活力、凋亡率以及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3)的改变和STAT3蛋白的变化。在体内研究中,将人肺癌A549细胞株接种于BALB/c-nu裸鼠腋部皮下,在咪达唑仑干预的作用下,观察移植瘤重量以及体积指标的变化,取荷瘤裸鼠移植瘤组织进行形态学及病理学检查;在探讨对肺癌细胞作用及其机制方面,运用HE染色观察咪达唑仑对移植瘤组织细胞形态的影响;通过TUNEL染色检测移植瘤组织肿瘤细胞凋亡;采用免疫组织化学染色观察移植瘤组织细胞中Ki 67的变化以及western-blot检测观察移植瘤组织中STAT3蛋白的变化,在体内研究层面再次探讨及验证咪达唑仑对肺癌细胞的作用及机制。结果:体外研究中,MTT结果表明不同浓度咪达唑仑(10、20、40、80μg/ml)分别作用24 h及48 h后以剂量依赖的方式抑制A549细胞增殖,不同浓度的咪达唑仑作用于A549细胞48 h后,A549细胞生长抑制率在12.9-79.8%之间,用IC_(50)计算软件得出咪达唑仑作用于A549细胞48 h后半数抑制浓度IC_(50)值为20±5μg/ml。故以IC_(50)的1/2,即10μg/ml作为后续实验(咪达唑仑诱导A549细胞凋亡机制)的药物浓度;DAPI染色和死/活染色均表明不同浓度咪达唑仑(10、20μg/m L)作用后,与对照组(0μg/mL)相比,A549细胞生长数量明显减少,咪达唑仑对肺癌A549细胞具促凋亡作用;流式细胞检测表明咪达唑仑(10、20μg/mL)给药后,咪达唑仑给药浓度从10μg/mL增加到20μg/m L,A549细胞凋亡率从5.3%上升至12.3%;western-blot结果显示,咪达唑仑促进Bax,caspase-3的表达上调,且伴随Bcl-2的表达下调;此外,不同浓度咪达唑仑还可以下调A549细胞中STAT3的表达;由此可见,咪达唑仑浓度为10μg/mL即可诱导A549细胞发生显著的凋亡并引起凋亡相关蛋白的改变。为探讨STAT3是否参与咪达唑仑对人肺癌A549细胞的促凋亡作用,将STAT3 siRNA转染A549细胞后,western-blot结果显示STAT3的蛋白表达发生下调;将咪达唑仑单独作用、STAT3siRNA转染A549细胞以及联合咪达唑仑作用A549细胞后,与空白对照组、咪达唑仑单独作用组、STAT3 siRNA转染组相比,DAPI染色的结果显示STAT3siRNA转染联合咪达唑仑作用组A549细胞发生明显凋亡;同样流式检测结果显示STAT3 siRNA转染联合咪达唑仑作用组诱导A549细胞发生显著的凋亡(凋亡率为12.5%);western-blot结果显示STAT3 siRNA转染联合咪达唑仑作用组显著上调Bax以及caspase-3表达,同时下调Bcl-2以及STAT3蛋白的表达;对咪达唑仑是否通过STAT3发挥对A549细胞的促凋亡作用这一机制的上游进行探讨的过程中,首先利用生物信息学工具microRNA.org-Targets and Expression对STAT3的靶miRNA进行预测,结果提示可能为mi RNA-520d;在A549细胞系中STAT3与miRNA-520d的表达呈负相关;在A549细胞系中转染miRNA-520d mimic后,STAT3的表达下调;在A549细胞系中转染miRNA-520d inhibitor后STAT3的表达上调;双荧光素酶报告基因检测法结果显示miRNA-520d可以直接结合在STAT3的3′UTR;咪达唑仑作用后A549细胞中miRNA-520d的表达上调;咪达唑仑联合miRNA-520d mimic转染显著降低A549细胞的活力;咪达唑仑联合miRNA-520d mimic转染显著诱导A549细胞发生凋亡(凋亡率为13.9%);咪达唑仑联合miRNA-520d mimic转染显著上调Bax以及caspase-3表达,同时下调Bcl-2以及STAT3蛋白的表达。体内研究中,与对照组(生理盐水)相比,咪达唑仑(0.8 mg/kg)抑制肿瘤的生长,咪达唑仑干预组裸鼠移植瘤重量较轻,肿瘤体积小于对照组;HE染色显示咪达唑仑干预组裸鼠肺癌移植瘤组织有大面积坏死的改变,TUNEL染色结果示咪达唑仑干预组肿瘤细胞凋亡数目显著增多,免疫组织化学染色结果显示表明咪达唑仑可以显著下调肺癌移植瘤组织中Ki 67蛋白的表达,同时western-blot检测结果显示咪达唑仑可以下调肺癌移植瘤组织中STAT3蛋白的表达。结论:咪达唑仑在体外、体内均具有良好的抗肺癌细胞活性,体外对肺癌A549细胞的凋亡具有显著的诱导作用;STAT3可能是咪达唑仑诱导肺癌细胞凋亡的通路之一;mi RNA-520d在A549细胞系中可以通过结合在STAT3的3'UTR负向调节STAT3的表达从而诱导A549细胞发生凋亡。在成功建立人肺癌细胞裸鼠移植瘤模型的基础上,发现咪达唑仑对肺癌移植瘤具有良好的抑制作用;综上,咪达唑仑通过介导miRNA-520d调控STAT3通路,诱导肺癌细胞凋亡发挥抗肿瘤细胞作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2;R614
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分：咪达唑仑对人肺癌A549细胞凋亡的影响
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料与仪器
            2.1.1 实验细胞株
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 仪器设备
        2.2 A549肺癌细胞的培养
        2.3 咪达唑仑干预A549细胞
            2.3.1 MTT检测咪达唑仑诱导A549细胞凋亡
            2.3.2 免疫荧光
            2.3.3 死/活染色观察咪达唑仑作用后A549细胞的生长情况
            2.3.4 流式细胞仪观察A549细胞的凋亡情况
            2.3.5 Westernblot检测咪达唑仑对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响
        2.4 统计分析
    3 结果
        3.1 MTT结果
        3.2 DAPI染色结果
        3.3 死/活染色观察A549细胞生长状况
        3.4 流式细胞术检测A549细胞凋亡
        3.5 Western-blot检测观察凋亡相关蛋白表达
    4 讨论
    5 结论
第二部分：STAT3信号通路在咪达唑仑促人肺癌A549细胞凋亡作用中的变化
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要仪器设备及试剂
            2.1.1 主要仪器设备
            2.1.2 主要试剂及耗材
        2.2 实验步骤
        2.3 统计学处理
    3 结果
        3.1 各组A549细胞STAT3蛋白的表达
        3.2 STAT3siRNA转染A549细胞后STAT3表达的改变
        3.3 STAT3siRNA转染后A549细胞活力的改变
        3.4 siRNA转染后A549细胞形态的影响
        3.5 流式细胞仪检测A549细胞转染STAT3siRNA后细胞凋亡情况
        3.6 WesternBlot结果
    4 讨论
    5 结论
第三部分：咪达唑仑通过miR-520d在A549细胞系中对STAT3的调节诱导肺癌细胞凋亡的机制研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 应用生物信息学工具对miR-520家族的可能靶基因进行预测
            2.1.2 细胞株
            2.1.3 主要试剂
            2.1.4 主要试剂配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 实验分组
            2.2.2 采用RT-PCR法检测10μg/ml咪达唑仑作用于A549细胞48h后miR-520dmRNA的表达情况
            2.2.3 采用WesternBlot法检测咪达唑仑（10μg/ml）作用于A549细胞48h后STAT3蛋白的表达情况
            2.2.4 细胞转染
        2.3 统计学分析
    3 结果
        3.1 生物信息学工具预测
        3.2 转染miR-520dmimic后STAT3蛋白表达
        3.3 转染miRNA-520dinhibitor后STAT3蛋白表达
        3.4 双荧光素酶报告系统
        3.5 咪达唑仑干预后A549细胞中miR-520d表达变化
        3.6 各组A549细胞活力的变化
        3.7 流式细胞技术检测各组细胞凋亡率
        3.8 Westernblot检测咪达唑仑联合miRNA-520dmimic转染干预后A549细胞中凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、casepase-3）以及STAT3的变化
        3.9 Westernblot检测咪达唑仑联合miRNA-520dinhibotor转染干预后A549细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、casepase-3）以及STAT3的变化
    4 讨论
    5 结论
第四部分：咪达唑仑对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用和机制
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 细胞株
        2.2 实验动物
        2.3 实验器材
        2.4 实验试剂
        2.5 主要试剂配制
        2.6 动物模型建立
        2.7 分组及给药
        2.8 HE染色观察肿瘤病理变化
            2.8.1 制备病理切片
            2.8.2 HE染色
        2.9 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡
        2.10 免疫组织化学检测移植瘤组织中Ki67的表达
        2.11 蛋白质印迹法检测STAT3蛋白的表达
        2.12 统计分析
    3 结果
        3.1 咪达唑仑对A549细胞皮下移植瘤生长的影响
        3.2 HE染色结果
        3.3 TUNEL染色
        3.4 免疫组化显示移植瘤组织中Ki67的变化
        3.5 Western-blot法检测咪达唑仑对荷瘤裸鼠肺癌肿瘤组织STAT3蛋白表达的影响
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
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