炎症因子调节硫酸软骨素合成酶在椎间盘退变中机制研究

发布时间：2020-11-16 02:20

　　 研究目的:下腰痛为困扰当代中老年人乃至年轻人的重要疾患,其每年给国家带来巨大的经济损失以及社会负担。目前认为下腰痛的主要病因为椎间盘退变,椎间盘退变在临床上很常见,其主要表现为椎间盘含水量降低,椎间高度降低;椎间盘含水量的决定分子为其基质成分内的硫酸软骨素,硫酸软骨素的合成由多种合成酶催化,但其在椎间盘退变中的作用鲜有研究。硫酸软骨素已被发现在椎间盘退变中表达降低,但其调控机制尚不清楚,目前大量研究提示炎症因子与椎间盘基质代谢密切相关,我们的预实验结果提示促炎因子白细胞介素-1β可直接下调硫酸软骨素的合成,而抗炎因子转化生长因子-β则促进硫酸软骨素合成,我们进一步假设该调节作用可能是通过其对硫酸软骨素合酶的调控实现,阐明该调控机制有助于在其中寻找相关治疗靶点,从而籍此提高椎间盘硫酸软骨素的合成水平,恢复退变椎间盘的含水量,从而延缓甚至逆转椎间盘退变的进程。研究方法:该项目在组织层面使用免疫组织化学法及quantitive real-time PCR(RT-PCR)法检测硫酸软骨素合酶的表达水平,使用免疫荧光法以及DMMB法检测硫酸软骨素的水平,使用高通量转录组测序法检测潜在microRNA靶点。细胞层面使用大鼠及人髓核细胞作为研究对象,使用RT-PCR法、Western-Blot法以及双荧光素酶报告基因法在不同维度检测硫酸软骨素合酶的表达水平,使用免疫荧光法检测髓核细胞硫酸软骨素合酶表达的位置及水平,使用搭载不同干扰shRNA的慢病毒载体转染髓核细胞,WesternBlot法以及双荧光素酶报告基因法检测其中不同信号通路蛋白的活化水平。研究结果:该研究发现抗炎因子TGF-β在上调大鼠髓核细胞CHSY-1以及CHPF的水平,TGF-β对CHSY-1的调控部分依赖经典的Smad信号通路,其主要通过AP1、SP1以及MAPK通路对CHSY-1起调控作用,使用慢病毒载体敲除大鼠髓核细胞CHSY-1可降低髓核细胞以及TGF-β诱导下的髓核细胞合成硫酸软骨素;TGF-β可通过经典Smad通路上调CHPF的表达,MAPK通路以及RhoA/ROCK1信号也参与了TGF-β诱导的CHPF表达。使用慢病毒载体敲除大鼠髓核细胞CHPF也可降低髓核细胞以及TGF-β诱导下的髓核细胞合成硫酸软骨素。以上结果提示CHSY-1以及CHPF对髓核细胞硫酸软骨素的合成起关键作用。但通过对人退变髓核组织CHSY-1、CHPF以及TGF-β的关系进行分析后,发现CHSY-1以及CHPF表达降低,同时伴随TGF-β高表达。提示在椎间盘退变过程中CHSY-1以及CHPF的调节还有其他机制参与。我们进一步关注了促炎因子IL-1β对硫酸软骨素合酶家族的调控,发现IL-1β可下调CHSY-1,2,3的表达,且IL-1β在退变髓核组织中高表达,该结果提示IL-1β在退变环境下对硫酸软骨素合酶的调控相较于TGF-β占主导地位,通过microRNA高通量转录组测序,发现IL-1β对CHSYs家族基因的调节以及髓核细胞硫酸软骨素的合成依赖microRNA-194以及microRNA-515,该研究结果提示microRNAs参与促炎因子对硫酸软骨素及其合酶的调控。研究结论:椎间盘退变中硫酸软骨素含量降低为髓核组织含水量降低的重要原因,硫酸软骨素合酶家族基因在椎间盘退变中表达显著降低可能为导致硫酸软骨素含量降低的重要原因。促炎因子IL-1β及抗炎因子TGF-β均参与对硫酸软骨素合酶家族基因的调控,促炎-抗炎平衡失调可能为硫酸软骨素家族基因在椎间盘退变中显著下调以及硫酸软骨素合成降低的重要原因。MAPK、Smad、RhoA/ROCK信号介导抗炎因子对硫酸软骨素合酶基因的调控,椎间盘退变中这些通路在促炎因子作用下的应答改变可能为TGF-β对硫酸软骨素合酶调控失偶联的重要原因。促炎因子IL-β可显著降低硫酸软骨素合酶基因的表达以及硫酸软骨素的合成,且该调节过程依赖于microRNA-194以及micro-RNA-515的参与,通过对以上调控机制的阐明,为未来寻找椎间盘退变生物治疗中的潜在治疗靶点提供了新的科学依据。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R681.5
【部分图文】：

- 26 -图 1 TGF-β在大鼠髓核细胞正调节 CHSY-1 的表达前期研究已有报道指出 TGF-β可诱导髓核细胞硫酸软骨素蛋白聚糖的合成。CHSY-1 为硫酸软骨素蛋白聚糖骨干糖链延长过程的重要合酶。为检测 CHSY-1 的表达是否接受 TGF-β的调节，我们使用 TGF-β对大鼠髓核细胞进行刺激。结果显示，CHSY-1 的mRNA 水平及蛋白水平在 TGF-β的作用下显著上升，从时间梯度实验可以看出，TGF-β对 CHSY-1 的诱导作用在 4 小时已可被检测到，而在 24 小时达到高峰（图 1A 和图1B），该结果提 TGF-β对 CHSY-1 的调节存在时间依赖性；此外，通过浓度梯度实验可以看出，不同浓度的 TGF-β均可上调 CHSY-1 的表达，并随着 TGF-β浓度的上升，该刺激作用逐渐增强，该结果提示 TGF-β对 CHSY-1 的刺激也存在浓度依赖性（图 1C 和图 1D）。进一步通过免疫荧光实验证实，TGF-β诱导的 CHSY-1 的表达亚细胞定位位于细胞质内，并且荧光强度在 TGF-β的刺激组显著增强，证实了提示 CHSY-1 接受 TGF-β的调节；为验证该调控作用是否在转录水平起效，我们使用双荧光素酶报告基因实

1. 材料同上2. 方法2.1 实验方法同上2.2 统计学分析所有数据均采用均数±标准差的形式呈现，每次实验至少进行了三次独立的重复，每 次 实 验 中 的 每 个 实 验 组 均 设 置 三 次 重 复 。 数 据 的 正 态 性 检 验 使 用D'Agostino & Pearson omnibus normality 检验。不满足正态分布的数据使用 Two-tailedMann-Whitney U 检验。Two-tailed Student T 检验用于分析两组间差异的显著性。OnewayANOVA以及Bonferronipost-hoc检验用于分析多组间差异的显著性。GraphpadPrismv6.0 为用于统计分析的软件。P<0.05 则认定组间的差异具有显著性。3. 结果

节作用1. 材料同上2. 方法2.1 实验方法同上2.2 统计学分析所有数据均采用均数±标准差的形式呈现，每次实验至少进行了三次独立的重复，每 次 实 验 中 的 每 个 实 验 组 均 设 置 三 次 重 复 。 数 据 的 正 态 性 检 验 使 用D'Agostino & Pearson omnibus normality 检验。不满足正态分布的数据使用 Two-taileMann-Whitney U 检验。Two-tailed Student T 检验用于分析两组间差异的显著性。OnewayANOVA以及Bonferronipost-hoc检验用于分析多组间差异的显著性。GraphpadPrismv6.0 为用于统计分析的软件。P<0.05 则认定组间的差异具有显著性。3. 结果
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本文编号：2885502