RIPK4对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响及机制研究

发布时间：2020-11-16 04:27

　　 目的:探讨下调受体相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase4,RIPK4)基因的表达对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。同时探讨下调受体相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase 4,RIPK4)基因可能通过抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信号通路调控骨肉瘤MG-63细胞的增殖和凋亡。方法:(1)采用脂质体转染法将特异性针对RIPK4基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞(RIPK4-siRNA转染组),以转染阴性对照siRNA(negative controll RNA,NC-siRNA)作为阴性对照,同时建立TNF-α处理MG-63细胞的阳性对照组以及RIPK4-siRNA转染MG-63细胞后再行TNF-α处理组。EdU法检测MG-63细胞增殖情况,Hoechst 33258染色法检测MG-63细胞凋亡情况,蛋白质印记法检测MG-63细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xl及caspase-3表达情况。(2)采用脂质体转染法将特异性针对RIPK4基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞(RIPK4-siRNA转染组),以转染阴性对照-siRNA(negative control-RNA,NC-siRNA)作为阴性对照组,同时建立AKT抑制剂Perifosine(KRX-0401)组及空白对照组。采用免疫荧光染色法初步观察骨肉瘤细胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表达情况。采用蛋白质印迹法检测骨肉瘤MG-63细胞中RIPK4、PI3K、AKT、mTOR、Gsk3β及NF-κB蛋白的表达情况。采用蛋白质印迹法检测骨肉瘤MG-63细胞中细胞周期调节蛋白p53、p21及抗凋亡蛋白Bcl-2,促凋亡蛋白Bad的表达情况。结果:(1)RIPK4-siRNA转染MG-63细胞后,RIPK4蛋白的表达水平明显下调(P0.05)。EdU法检测结果显示,RIPK4-siRNA转染组、NC-siRNA转染组、TNF-α阳性对照组和RIPK4-siRNA转染+TNF-α组细胞的EdU阳性表达率分别为60.7%、39.6%、43.3%和16.7%,RIPK4-siRNA转染组细胞的增殖能力较RIPK4-siRNA转染组明显降低(P0.05),RIPK4-siRNA转染+TNF-α组细胞的增殖能力较RIPK4-siRNA转染组和TNF-α阳性对照组明显降低(P值均0.05)。Hoechst 33258染色结果显示,RIPK4-siRNA转染组发生凋亡的细胞数较NC-siRNA转染组增多(P0.05),RIPK4-siRNA转染+TNF-α组发生凋亡的细胞数较RIPK4-siRNA转染组和TNF-α阳性对照组明显增多(P值均0.05)。沉默RIPK4基因后Bax蛋白和caspase-3蛋白表达水平增高,Bcl-xl蛋白表达水平下调,与NC-siRNA组比较,差异均有统计学意义(P值均0.05);RIPK4-siRNA转染+TNF-α组中Bax蛋白和caspase-3蛋白表达水平均较RIPK4-siRNA转染组和TNF-α阳性对照组上调,Bcl-xl蛋白的表达水平下调,差异具有统计学意义(P值均0.05)。(2)免疫荧光染色法检测显示:与空白对照组、NC-siRNA组相比,RIPK4-siRNA转染MG-63细胞后PI3K蛋白表达变化无明显变化,AKT及mTOR蛋白的变化下调,NF-κB蛋白在细胞核中的表达上调。进一步用蛋白质印迹法检测结果显示:与空白对照组、NC-siRNA组相比,RIPK4-siRNA转染组MG-63细胞中RIPK4蛋白的表达量明显下调(P0.05);与空白对照组、NC-siRNA组相比,RIPK4-siRNA转染组MG-63细胞中PIK3蛋白的表达并无明显的变化;与空白对照组、NC-siRNA组相比,RIPK4-siRNA转染组及Akt抑制剂Perifosine(KRX-0401)MG-63细胞中Akt、mTOR蛋白的表达量明显下调,有显著的统计学意义(#P0.05)。与空白对照组、NC-siRNA组相比,RIPK4-siRNA转染组及Akt抑制剂Perifosine(KRX-0401)MG-63细胞中GSK3β蛋白蛋白的表达显著上调(P0.05),NF-κB蛋白的表达显著下调(P0.05)。同时发现Akt抑制剂Perifosine(KRX-0401)对RIPK4蛋白的表达并无明显影响,没有统计学意义(*P0.05);RIPK4-siRNA转染组与Akt抑制剂Perifosine(KRX-0401)组相比骨肉瘤细胞中Akt蛋白的表达上调(*P0.05),但NF-κB蛋白的表达量则明显下调(P0.05)。RIPK4-siRNA转染组和Akt抑制剂Perifosine(KRX-0401)干扰组与空白对照组、NC-siRNA组相比中细胞周期调节蛋白p53、p21和促凋亡蛋白Bad的表达上调(P0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2则下调(P0.05)。结论:下调RIPK4基因表达可诱导骨肉瘤MG-63细胞发生凋亡,并且可以促进TNF-α诱导细胞发生凋亡。RIPK4基因可能通过AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信号通路调控骨肉瘤MG-63细胞的增殖和凋亡。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R738.1
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 骨肉瘤的特点与现状
        1.1.1 骨肉瘤的特征
        1.1.2 骨肉瘤的临床特点及预后
        1.1.3 骨肉瘤的临床治疗现状
    1.2 RIPK4基因的功能
        1.2.1 RIPK4基因概述
        1.2.2 RIPK4基因在正常组织中的生物学功能
        1.2.3 RIPK4与肿瘤之间的关系
        1.2.4 RIPK4与细胞通路的关系
第二章 下调RIPK4基因表达增强TNF-α诱导细胞凋亡的敏感性
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系来源
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要实验试剂
        2.1.4 配制相关实验溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养及传代
        2.2.2 冻存和复苏细胞
        2.2.3 细胞的siRNA转染
        2.2.4 蛋白质印迹法检测MG-63细胞中RIPK4蛋白的表达情况
        2.2.5 Hoechst33258染色法观察细胞凋亡
        2.2.6 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）法检测MG-63细胞增殖
        2.2.7 蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达
        2.2.8 统计学方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 RIPK4-siRNA下调MG-63细胞中RIPK4蛋白的表达
        2.3.2 沉默RIPK4基因表达可抑制MG-63细胞增殖
        2.3.3 沉默RIPK4基因表达以及联合TNF-α对MG-63细胞凋亡的影响
        2.3.4 沉默RIPK4基因表达以及联合TNF-α对MG-63细胞中Bax、Bcl-xL及caspase-3蛋白表达的影响
    2.4 讨论
第三章 RIPK4可能通过抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信号通路调控骨肉瘤MG-63细胞的增值和凋亡
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞系来源
        3.1.2 主要实验仪器
        3.1.3 主要实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞复苏、培养与传代
        3.2.2 细胞siRNA转染
        3.2.3 免疫荧光染色法初步观察下调RIPK4基因后骨肉瘤细胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表达情况
        3.2.4 蛋白质印迹法检测细胞中PI3K、AKT、mTOR、GSK3β及NF-κB蛋白的表达情况
        3.2.5 蛋白质印迹法检测细胞周期调控蛋白p21、p53和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bad的表达
        3.2.6 统计学方法
    3.3 结果
        3.3.1 RIPK4-siRNA下调MG-63细胞中AKT、mTOR蛋白的表达并上调NF-κB蛋白在细胞核中的表达
        3.3.2 RIPK4-siRNA影响AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信号通路相关蛋白的表达
        3.3.3 RIPK4-siRNA可能通过AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信号通路调控骨肉瘤MG-63细胞的增值和凋亡
    3.4 讨论
第四章 结论
    4.1 主要结论
    4.2 研究展望
参考文献
英文缩略词
在学期间的研究成果
致谢

【参考文献】

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本文编号：2885619