研究背景随着人口数量增长,人口老龄化程度加剧及致癌因素的普遍性,癌症发病率和病死率呈上升趋势。目前,我国癌症的发病率略次于美国位列全球第二,癌症病死率位于各国之首,发病率和病死率远远高于世界平均水平。癌痛是中晚期癌症患者不可避免的问题。骨癌痛(BCP)是最常见的癌痛类型,常由原发性骨肿瘤或肿瘤继发骨转移引起。原发骨肿瘤及约三分之一肿瘤骨转移的患者都会出现不同程度的骨痛,约三分之二的晚期癌症都倾向于骨转移,常转移至后腰部、骨盆、长骨及肋骨。尽管骨骼不是重要器官,很多常见的肿瘤都容易发生骨转移。肿瘤的骨转移被认为是BCP形成的最常见原因,肿瘤转移至骨骼及侵犯周围组织,可导致疼痛,后者及伴随的高钙血症、易感染、病理性骨折及脊柱稳定性差,不仅影响患者的生活质量,亦可导致患者的抑郁和焦虑,给家庭和社会造成沉重负担。现有的镇痛药物或疗法,包括阿片类药物,非甾体类抗炎药物、双膦酸盐类药物及放疗,常无法达到足够的镇痛效果或伴有严重不良反应。因此,明确BCP形成和维持机制及发现有效的治疗方法对于改善患者的生活质量,减轻家庭和社会负担具有一定意义。内皮素-1(ET-1)是由二十一个氨基酸组成的多肽链,是人体内含量最多的三种内皮素之一。作为神经调质,其广泛表达于中枢神经系统,参与多种疼痛调节。其调节疼痛主要是通过活化内皮素A受体(ETAR)和内皮素B受体(ETBR)实现的,两者皆为其特异性G蛋白偶联受体。ET-1在疼痛调节中发挥重要作用,鞘内注射ET-1可减轻疼痛模型动物的疼痛。相同地,在炎性痛和神经病理性痛模型中,星形胶质细胞过表达ET-1小鼠表现出疼痛减轻,而神经元特异性ET-1敲除小鼠则显示出了相反的结果。在神经病理性痛中,ET-1、ETAR和ETBR表达上调,共同参与疼痛的调节。BCP具有神经病理性痛特征,而ET-1、ETAR和ETBR在BCP中的表达变化,尚不清楚。蛋白激酶B(Akt)是介导多种细胞增殖、存活和分化的信号传导通路,广泛表达于脊髓背角Ⅰ-Ⅳ层,调节伤害性刺激。其参与炎性痛和神经病理性痛引发的中枢敏化。除Akt外,细胞外调节激酶(ERK)信号通路在突触和神经元可塑性的调节中也发挥重要作用,它同样调节伤害性刺激诱发的外周和中枢敏化。脊髓Akt和ERK通路存在交叉和联系,共同参与神经病理性痛时机体的病理生理学和神经化学变化。在神经病理性痛中脊髓Akt和ERK表达上调,共同促进疼痛的发展。BCP具有神经病理性痛特征,而脊髓Akt和ERK通路在BCP中的作用,尚不清楚。尽管ET-1调节疼痛通过活化ETAR和ETBR实现,但主要是通过ETAR介导的。如当ET-1施加于暴露的坐骨神经外时,大鼠产生患侧后爪退缩,这种作用可被提前腹腔注射吗啡阻断或完全预防,注射ETAR拮抗剂可逆转,但ETBR拮抗剂无效。在热痛模型中,中枢给予ET-1的镇痛作用可被ETAR拮抗剂阻断,而ETBR拮抗剂无效,表明ET-1在中枢神经系统的镇痛作用通过ETAR,而非ETBR介导。在脊髓损伤模型中,鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123可减轻神经病理性痛,而ETBR拮抗剂BQ-788无效,此结果表明,ET-1调节疼痛通过ETAR,并不通过ETBR。脊髓Akt和ERK表达上调参与神经病理性痛的而形成和维持,而抑制Akt和ERK或其上游蛋白的表达可减轻疼痛。鞘内注射ETAR受体拮抗剂BQ-123可下调神经病理性痛小鼠脊髓Akt和ERK表达而减轻疼痛。由于BCP具有神经病理性痛特征,鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响及机制,尚不清楚。本研究一方面旨在明确脊髓ET-1及其受体在BCP中变化,同时评价脊髓Akt和ERK通路在BCP成形和维持中的作用,为明确BCP机制,发现可能的治疗靶点提供依据;另一方面,通过评价鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响,明确了其减轻BCP的可能分子机制,可为临床BCP治疗方法的研究提供新方向。本研究分为两部分,第一部分:脊髓ET-1及其受体、Akt和ERK通路在BCP中的变化;第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻对小鼠BCP。研究目的第一部分:小鼠BCP模型制备成功后,通过检测痛行为学、组织学、脊髓ET-1、ETAR和ETBR基因表达及蛋白表达,Akt和ERK通路蛋白表达,明确ET-1及其受体在BCP中的变化及脊髓Akt和ERK通路在BCP形成和维持中的作用。第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123后,通过检测小鼠痛行为学及脊髓Akt和ERK通路蛋白表达,明确鞘内注射BQ-123对小鼠BCP的影响及可能机制。研究方法第一部分:NCTC 2472肿瘤细胞系培养于含10%马血清NCTC 135培养基,培养箱参数设置为37℃,5%CO2和95%02,细胞每周传代两次。雄性C3H/HeJ小鼠,4～6周龄,体质量20～25 g,采用股骨骨髓腔接种NCTC 2472肿瘤细胞的方法制备BCP模型。将小鼠随机分为两组:假手术组(Sham组)和骨癌痛组(BCP组)。每组随机选择8只小鼠固定行痛行为学检测,包括自发抬足次数(NSF)和机械缩足反应阈(PWT)。采用盲法,痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。于肿瘤细胞接种后-1、7、14和21 d分别检测NSF和PWT,随后每组随机处死5只小鼠,取脊髓L4-6节段,采用实时定量PCR法检测ET-1mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 表达水平。采用 Western blot 法检测 ET-1、ETAR和ETBR蛋白表达,同时检测磷酸化Akt(p-Akt)、总Akt(t-Akt)、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)和总 ERK-1/2(t-ERK-1/2)表达,并计算 p-Akt/t-Akt 和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。于肿瘤细胞接种后21d,各组分别取患侧股骨行组织学检测。第二部分:将小鼠随机分为7组:Sham+NS组、Sham+BQ-123组、Sham+BQ-788组、BCP组、BCP+NS、BCP+BQ-123和BCP+BQ-788组。每组随机选择8只小鼠固定行NSF检测,另选择8只小鼠固定行PWT检测。选择L5-6椎间孔穿刺行鞘内注射给药。于肿瘤细胞接种后14d(痛行为学检测后)行鞘内注射,Sham+BQ-123组和 BCP+BQ-123组小鼠分别鞘内注射BQ-123(30 nmol in7 μl per dose),Sham+BQ-788组和BCP+BQ-788组小鼠分别鞘内注射BQ-788(10 nmol in 7μlper dose),Sham+NS组和BCP+NS组注入等量生理盐水,注射速度为1 μl/s。痛行为学检测于鞘内注射前即刻及注射后每30 min检测一次,至注射后180 min。采用盲法,痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。痛行为学检测中,于BCP+BQ-123组痛行为学改善最明显的时点,每组随机选择5只小鼠,处死后取脊髓L4-6节段,采用Western boot法检测p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2及t-ERK-1/2的表达水平,并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。结果第一部分:与-1d时比较,Sham组于肿瘤细胞接种后4、7、10、14和21 d时NSF和PWT变化差异无统计学意义(P0.05),BCP组于肿瘤细胞接种后7、10、14 和 21d 时 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001);与 Sham 组比较,BCP 组小鼠 7、10、14 和 21 d 时 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001)。组织学结果表明,BCP组小鼠出现肿瘤生长和骨质破坏,肿瘤细胞严重浸润和侵蚀骨皮质,而Sham组小鼠骨质结构基本正常。与-1 d 时比较,Sham 组小鼠 7 d、14 d 和 21 d 时 ET-1 mRNA、ETARmRNA和ETBRmRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P0.05),BCP组小鼠14d和21 d 时 ET-1 mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 及蛋白表达上调(P0.05、0.01或0.001),7d时差异无统计学意义(P0.05)。与Sham组比较,BCP组小鼠 7、14、21d 时 ET-1mRNA、ETARmRNA 和 ETBRmRNA 及蛋白表达上调(P0.05,0.01或0.001)。在观察时点内,Sham组小鼠p-Akt、p-ERK-1/2表达及p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2并未见明显变化,而BCP组小鼠上述指标呈现时间依赖式的表达上调。与Sham组比较,BCP组小鼠7 d、14 d和21 d时p-Akt和p-ERK-1/2表达上调,p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 增加(P0.05、0.01 或 0.001)。第二部分:与 Sham+NS 组、Sham+BQ-123 组、Sham+BQ-788 组比较,BCP组、BCP+NS和BCP+BQ-788组小鼠表现为NSF升高和PWT降低(P0.001),且痛行为学指标在鞘内注射后180min的观察时间内基本保持不变。而鞘内注射后,BCP+BQ-123组痛行为学出现了“V”字型变化,表现为NSF在鞘内注射后0～90 min内急剧下降,90 min时达到最低点,90 min后开始急剧上升,180min时基本回复至鞘内注射前水平。PWT的变化趋势与NSF完全相反。因此,于鞘内注射后90 min时,每组随机选择5只小鼠,处死后取脊髓L4-6节段,采用Westem blot 法检测磷酸化 p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2 和 t-ERK-1/2 水平,并计算 p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。结果显示,与 BCP 组和 BCP+NS 组比较,BCP+BQ-123组小鼠脊髓 p-Akt、p-ERK-1/2 表达下调,p-Akt/t-Akt 和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 降低(P0.001)。结论第一部分:脊髓ET-1及其受体参与BCP的维持,脊髓Akt和ERK通路在BCP的形成和维持中发挥重要作用。第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂可能通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻小鼠BCP。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R614
【文章目录】：中文摘要
英文摘要
符号说明
前言
研究一 脊髓内皮素-1及其受体、Akt和ERK通路在骨癌痛中的变化
1. 研究背景
2. 材料与方法
3. 结果
4. 讨论
5. 结论
研究二 鞘内注射内皮素A受体拮抗剂通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻对小鼠骨癌痛
1. 研究背景
2. 材料与方法
3. 结果
4. 讨论
5. 结论
附图表
细胞培养及实验室检测流程
参考文献
致谢
攻读学位期间发表学术论文目录
英文论文一
英文论文二
学位论文评阅及答辩情况表
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 王建国;鞘内注射齐考诺肽治疗癌症或AIDS疼痛有效[J];国外医学(药学分册);2004年04期
2 马海艳,康京凤;小儿急性淋巴细胞性白血病鞘内注射的护理[J];河南医药信息;2002年11期
3 张群强,彭孝廉;鞘内注射MTX过量一例临床观察[J];临床内科杂志;1989年03期
4 魏淑景;宣宝和;;误用大剂量甲氨喋呤鞘内注射引起严重反应抢救成功1例[J];临床误诊误治;1989年02期
5 郭春杰;曲怀谦;;鞘内注射胞二磷胆碱治疗去皮层状态5例报告[J];中风与神经疾病杂志;1989年04期
6 李艳;;护理干预在急性白血病鞘内注射化疗中的作用[J];中国医药导报;2011年05期
7 唐静;王育琴;;长春新碱误行鞘内注射致严重神经损害及预防[J];药物不良反应杂志;2007年06期
8 陈美;鞘内注射化疗的护理[J];交通医学;2003年05期
9 陈燕,宋超英;鞘内注射防治中枢神经系统白血病38例分析[J];山西临床医药;2001年08期
10 申红霞;张泰;于宝东;;甲氨蝶呤和阿糖胞苷鞘内注射致精神症状1例[J];中国新药与临床杂志;2014年09期
相关博士学位论文 前10条
1 韩明明;鞘内注射内皮素A受体拮抗剂对小鼠骨癌痛的影响及机制研究[D];山东大学;2018年
2 王红;鞘内注射ω-芋螺毒素S03对慢性神经源性疼痛的镇痛效应及其机理的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
3 陈新勇;鞘内注射抗促肾上腺皮质激素释放激素血清对针刺夹脊穴镇痛的影响及机制研究[D];山东中医药大学;2011年
4 彭建伟;鞘内纤溶治疗脑室出血的实验与临床观察研究[D];郑州大学;2011年
5 汪婉;鞘内注射ssAAV9-DAO对ALS转基因小鼠模型的保护作用及机制研究[D];河北医科大学;2017年
6 马国平;血小板活化因子在脊髓水平的疼痛调控作用[D];华中科技大学;2009年
7 张旭彤;芬太尼与布托啡诺对镇痛效应联合作用的分子药理学机制[D];苏州大学;2016年
8 张丹;冰片(+Borneol)对脊柱肿瘤术后病人切口疼痛的镇痛作用及其分子生物学机制研究[D];第二军医大学;2016年
9 王莹;scAAV9-VEGF-165对ALS转基因小鼠的治疗作用及其作用机制研究[D];河北医科大学;2017年
10 孙涛;脊髓星形胶质细胞参与神经病理性疼痛调制的实验研究[D];华中科技大学;2007年
相关硕士学位论文 前10条
1 李冬晓;鞘内注射速度对AAV介导的microRNA在ALS模型小鼠中的治疗效果研究[D];河北医科大学;2017年
2 张维;鞘内注射医用臭氧的神经毒性研究[D];山东大学;2006年
3 李明明;鞘内注射神经妥乐平的安全性及抗炎镇痛作用[D];郑州大学;2015年
4 凌容;两性霉素B椎管内持续给药和鞘内注射安全性对照研究[D];南方医科大学;2014年
5 王朝辉;不同剂量右美托咪定鞘内注射的临床对照研究[D];皖南医学院;2014年
6 曹艳丽;鞘内注射丁丙诺啡超前镇痛的实验研究[D];广西医科大学;2007年
7 黄俊杰;鞘内注射布美他尼对大鼠急性疼痛行为及钠钾氯联合转运蛋白1表达的影响[D];广州医学院;2012年
8 谢军明;鞘内注射重组大鼠白细胞介素18对大鼠吗啡耐受形成的影响[D];南京大学;2013年
9 李新宇;鞘内注射小剂量罗哌卡因混合舒芬太尼在经尿道前列腺切除术中的应用[D];延边大学;2008年
10 孙超;鞘内注射万古霉素治疗开颅术后颅内感染疗效分析[D];吉林大学;2008年
本文编号：
2889285
