CaMKⅡγ对大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响

发布时间：2021-04-12 07:37

　　[目 的]通过构建CaMKIIγ慢病毒并转染稳定传代的大鼠肝细胞BRL-3 A,探究CaMKIIγ表达水平对大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响。[方 法]通过体外培养稳定传代的大鼠肝细胞BRL-3A系,构建CaMKIIγ过表达（LV-CaMKIIγ）、敲低（LV-CaMKIIγ shRNA）及相应空白载体的慢病毒体系,分别转染入大鼠肝细胞BRL-3A内并建立空白对照组。然后通过流式细胞仪检测转染效率,采用QRT-PCR法检测各组不同时间点的CaMKIIγ mRNA表达水平;Western blot法检测CaMKIIγ蛋白在各组不同时间点的表达水平;CCK-8法检测细胞生长情况并绘制生长曲线,用于检测不同时间的细胞计数;流式细胞仪法检测各组不同时间点的细胞周期。[结 果]（1）各组慢病毒均成功转染入大鼠肝细胞BRL-3A内;（2）应用QRT-PCR检测结果:感染后第1天,LV-CaMKIIγ组与CON组CaMKIIγmRNA相对表达量差异有意义（P<0.01）,LV-CaMKIIγ shRNA组与CON组无统计学意义（P>0.05）。感染后第 3 天、5 天、7 天,LV-Ca... 

【文章来源】：昆明医科大学云南省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２?ＣａＭＫＩＩｙ目的质粒转染２９３Ｔ细胞??

ＣａＭＫＩＩｙ过表达病毒ＬＶ－ＣａＭＫ２ｇ可感染２９３Ｔ细胞，并达到满意的表达ＣａＭＫＩｌｙ??效果。??（８）慢病毒滴度：??ＩＤ?Ｔｉｔｅｒ?（ＴＵ／ｍｌ）??ＬＶ－Ｃａｍｋ２ｇ（４２６３６－４）?２Ｅ＋９??阴性对照ＣＯＮ３３５?２Ｅ＋９??２．３．２?ＣａＭＫＩＩｙ?ｓｈＲＮＡ?慢病毒?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩｙ?ｓｈＲＮＡ?信息??（１）?ＣａＭＫＪＩｙｓｈＲＮＡ?设计??Ｔａｒｇｅｔ?Ｓｅｑ?ＧＣ％??ＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣ?５７．８９％??（２）基本信息??载体名称：ＧＶ４９３??元件顺序：ｈＵ６－ＭＣＳ－ＣＢｈ－ｇｃＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??对照编号：ＣＯＮ３１３??对照插入序列：丁?ＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ??Ｉｆ?ＧＶ４９３?Ｔ．－＾１??＞?中?ＭＣＳ??ｎ??图３?ＧＶ４９３载体图谱??（３）?ｏｌｉｇｏ合成信息：??１７??

２．９统计学分析??所有实验数据均使用ＳＰＳＳ１９．０进行统计学分析，测量数据表示为平均值士??标准差（３ｆ±ｓ），首先进行方差的齐性检验以确定方差齐同，组间比较采用单因??素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ＿ｔ检验，检验水准ａ＝０．０５。采用ＧｒａｐｈＰｓｄＰｒｉｓｍ??５．０软件进行作图。??结果??１慢病毒转染大鼠肝细胞ＢＲＬ－３Ａ情况??根据慢病毒感染大鼠肝细胞ＢＲＬ－３Ａ预实验确定的ＭＯＩ和感染条件后，进??行慢病毒感染大鼠肝细胞ＢＲＬ－３Ａ的正式实验，在完成感染实验步骤后，通过荧??光倒置显微镜，观察到靶基因荧光蛋白的表达，表明靶基因进入大鼠肝细胞??ＢＲＬ－３Ａ，并通过流式细胞仪检测，各组慢病毒感染效率在６０％以上。??■ＩＢ??Ｂ??焚光倒置显微镜下成像（ｌ〇〇ｘ）?倒置显微镜下成像（１００Ｘ）??图４?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩＹ组慢病毒感染细胞７２小时后绿色荧光的表达??ＨＭ??荧光倒置显微镜下成像（１００Ｘ）?倒置显微镜下成像（１００Ｘ）??图５?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩＹ－ＮＣ组慢病毒感染细胞７２小时后绿色荧光的表达??３０??


本文编号：3132913