microRNA-155通过下调ERK1/2水平影响人正常椎间盘髓核细胞退变的实验研究

发布时间：2021-11-17 02:45

　　第一部分:p GFP/h TERT/Neo转染正常人椎间盘髓核细胞构建稳定细胞目的:探讨h TERT（人端粒酶逆转录酶基因）重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性,为进一步探讨人椎间盘髓核细胞退变机制的实验研究提供标准细胞株。方法:通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染h TERT表达检测等步骤进行实验。XTT方法检测正常髓核细胞与转染h TERT髓核细胞生长曲线,RT-PCR检测两种细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖、BMP-2、IGF-1、TGF-β、BMP-4、COLLAGEN I、PDGF、FGF基因表达量,ELISA方法检测两种细胞外液Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达量,无血清培养基状态下细胞周期分析检测细胞凋亡,裸小鼠种植实验检测永生化髓核细胞的致瘤性实验并进行病理分析。结果:转染hTERT后NP细胞增殖加速,传了20代细胞仍未见老化,细胞内Ⅱ型胶原、糖胺多糖基因表达与正常髓核细胞第1代类似,细胞外液Ⅱ型胶原、糖胺多糖与正常髓核细胞第1代类似。而未转染h TERT的NP细胞传4⁵代增值基本停滞了。细胞... 

【文章来源】：暨南大学广东省 211工程院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

pGFP/hTERT/Neo构建示意图

的基因 hTERT 片段的结果，PCR 扩产物为 1.9 kb 和 1.4kb, 与预期结 amplified fragment of hTERT gene.1 2 3 4 5 6RT 鉴定结果,质粒pEGFP-hTERT经过果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGF pEGFP/hTERT gene.1 2 3 4

2.3kb1 2 3 4 5 6图3. 重组克隆pEGFP/hTERT 鉴定结果,质粒pEGFP-hTERT经过BamH1酶切后证实目的基因在3kb，与预期结果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGFP-hTERT 酶切结果。Fig.3. RT-PCR analyzed the pEGFP/hTERT gene.1 2 3 41.5kb400bp图 4. 转染 pEGFP- hTERT 后髓核细胞 hTERT 表达情况。质粒 pEGFP- hTERT 转染细胞后经过 RT-PCR 证实目的产物在 1.5kb，引用 RT-3 和 RT-4 两对引物完成，内参在 370bp，与预期的一致。1-marker. 2-阴性对照组。3-细胞转染后 24h。4-细胞转染后 72h。Fig.3. RT-PCR analyzed the hTERT gene.

【参考文献】：
期刊论文
[1]椎间盘退变对L4-L5在垂直载荷下生物力学行为特性的影响[J]. 胡迎春,欧亚龙,胡裔志,余兵浩.  生物医学工程学杂志. 2015(01)
[2]Immortalization of human umbilical vein endothelial cells with telomerase reverse transcriptase and simian virus 40 large T antigen[J]. 边昶,赵葵,童国新,朱永良,陈鹏.  Journal of Zhejiang University Science. 2005(07)



本文编号：3500056