基于SCR技术的多层rFN/CDH融合蛋白界面促成骨效应及其机制研究
发布时间：2022-01-11 06:11
背景自体骨是植骨材料的“金标准”,然而取骨会造成严重的并发症,临床需要大量高活性骨替代材料。成骨性、骨诱导性和骨传导性是影响骨愈合的核心因素。羟基磷灰石、β-磷酸三钙、多聚乳酸等合成材料及脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）等天然生物材料缺乏成骨前体细胞和成骨诱导因子,成骨活性十分有限。经典的组织工程骨（tissue engineered bone, TEB）成骨能力良好,但制备过程复杂,难以实现临床转化。骨髓中含有丰富的成骨相关细胞和因子,既往研究表明骨髓局部注射或与支架材料复合可促进骨愈合。通过选择性细胞滞留（selective cell retention,SCR）技术,可以有效地将骨髓中成骨成分富集于疏松多孔材料,从而实现高活性组织工程骨术中构建。由于制备过程中细胞外基质大量丢失,通常用于SCR技术的DBM支架材料骨髓富集效率相对有限,通过表面修饰增强支架材料粘附性是提高富集效率和特异性的有效手段。在前期研究中,课题组采用多聚赖氨酸、RADA-161水凝胶等修饰DBM支架材料,修饰后材料孔径缩小,对细胞物理拦截作用增强,材料骨髓富集效率和成骨...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１主要研究内容：（１）层层自组装构建ＬＢＬ－ｒＦＮ／ＣＤＨ多层蛋白界面修饰ＤＢＭ支架材料并检??
清表达的蛋白活性高于包涵体［３（）＿３２］。根据前期诱导实验结果，我们采用含０．５ｍＭ?ＩＰＴＧ??和０．５％甘油的ＬＢ培养基诱导培养含有ｒＦＮ／ＣＤＨ融合基因的Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ（ＤＥ３）重组细??菌，在细菌培养至培养基吸光度为０．６？０．８时，均出现少量可溶性表达（如图２Ａ所示），??但从电泳结果来看，纯化的蛋白纯度很差，虽然在目的分子位置有明显蛋白条带，但比??例仅２０％左右，其他可能为截断表达或者降解带，不适合用于实验。??如图３所示，包涵体蛋白提取，Ｎｉ２＋金属层析纯化后，１０％?Ｅｌｕｔｉｏｎ?Ｂｕｆｆｅｒ洗脱蛋白??中含有大量ｒＦＮ／ＣＤＨ融合蛋白（分子量７５ｋＤ），纯度高，可满足实验需求；１００％?Ｅｌｕｔｉｏｎ??Ｂｕｆｆｅｒ洗脱蛋白中含有较高纯度的融合蛋白；将纯化蛋白收集，以ＰＨ＝９．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ??透析纯化后，再次Ｎｉ２＋金属层析纯化后，三个批次制备的ｒＦＮ／ＣＤＨ融合蛋白均具有极??高的纯度，仅在分子量＞１３０ＫＤ处有一杂带，杂带分子量为ｒＦＮ／ＣＤＨ的二倍，考虑为??其二聚体。??一一?：：：＿?－??２９??
接触角反映的是材料表面对液体的亲疏程度，本研究中以去离子水作为测量溶液，??接触角越大，材料亲水性越高，反之亦然。材料的亲水性取决于材料表面的化学组成及??分子排列方式，因而在一定程度上可以反应材料表面成分的变化。如图４所示，脱蛋白??骨皮质（第〇层）接触角较大，亲水性差，表面修饰ＰＥＩ后（第１层），其接触角明显??降低，此后随修饰层数增加，接触角不规则变化。当修饰到第８层（－ＰＥＩ－ｒＦＮ／ＣＤＨ－??（Ｃｈｉ－ｒＦＮ／ＣＤＨ）３）以后，随修饰层数增力口，接触角波动在３４°（ｒＦＮ／ＣＤＨ）或４５°（Ｃｈｉ），??接触角趋于稳定，提示层成分随修饰层数增加外层结构稳定改变，即己形成稳定的修饰??界面。由于修饰体系中缺乏其他可稳定存留与材料表面的成分，我们可以推测这是由于??材料表面被Ｃｈｉ或ｒＦＮ／ＣＤＨ均匀涂布的结果，早期修饰过程中接触角不规则变化可能??与最外层修饰大分子不能完全占据材料表面有关［３ｋ３３］。由于后期选择性富集及体内外实??验要求材料具有良好的稳定性，我们采用修饰１２层的材料作为实验的最终材料，即??－ＰＥＩ－ｒＦＮ／ＣＤＨ－?（Ｃｈｉ－ｒＦＮ／ＣＤＨ）?５
【参考文献】：
期刊论文
[1]Platelet-rich plasma for regeneration of neural feedback pathways around dental implants: a concise review and outlook on future possibilities[J]. Yan Huang,Michael M Bornstein,Ivo Lambrichts,Hai-Yang Yu,Constantinus Politis,Reinhilde Jacobs. International Journal of Oral Science. 2017(01)
[2]Application of platelet-rich plasma with stem cells in bone and periodontal tissue engineering[J]. Gabriela Fernandes,Shuying Yang. Bone Research. 2016(04)
[3]Use of demineralized bone matrix in the extremities[J]. Georgios I Drosos,Panagiotis Touzopoulos,Athanasios Ververidis,Konstantinos Tilkeridis,Konstantinos Kazakos. World Journal of Orthopedics. 2015(02)
本文编号：3582249
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１主要研究内容：（１）层层自组装构建ＬＢＬ－ｒＦＮ／ＣＤＨ多层蛋白界面修饰ＤＢＭ支架材料并检??
清表达的蛋白活性高于包涵体［３（）＿３２］。根据前期诱导实验结果，我们采用含０．５ｍＭ?ＩＰＴＧ??和０．５％甘油的ＬＢ培养基诱导培养含有ｒＦＮ／ＣＤＨ融合基因的Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ（ＤＥ３）重组细??菌，在细菌培养至培养基吸光度为０．６？０．８时，均出现少量可溶性表达（如图２Ａ所示），??但从电泳结果来看，纯化的蛋白纯度很差，虽然在目的分子位置有明显蛋白条带，但比??例仅２０％左右，其他可能为截断表达或者降解带，不适合用于实验。??如图３所示，包涵体蛋白提取，Ｎｉ２＋金属层析纯化后，１０％?Ｅｌｕｔｉｏｎ?Ｂｕｆｆｅｒ洗脱蛋白??中含有大量ｒＦＮ／ＣＤＨ融合蛋白（分子量７５ｋＤ），纯度高，可满足实验需求；１００％?Ｅｌｕｔｉｏｎ??Ｂｕｆｆｅｒ洗脱蛋白中含有较高纯度的融合蛋白；将纯化蛋白收集，以ＰＨ＝９．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ??透析纯化后，再次Ｎｉ２＋金属层析纯化后，三个批次制备的ｒＦＮ／ＣＤＨ融合蛋白均具有极??高的纯度，仅在分子量＞１３０ＫＤ处有一杂带，杂带分子量为ｒＦＮ／ＣＤＨ的二倍，考虑为??其二聚体。??一一?：：：＿?－??２９??
接触角反映的是材料表面对液体的亲疏程度，本研究中以去离子水作为测量溶液，??接触角越大，材料亲水性越高，反之亦然。材料的亲水性取决于材料表面的化学组成及??分子排列方式，因而在一定程度上可以反应材料表面成分的变化。如图４所示，脱蛋白??骨皮质（第〇层）接触角较大，亲水性差，表面修饰ＰＥＩ后（第１层），其接触角明显??降低，此后随修饰层数增加，接触角不规则变化。当修饰到第８层（－ＰＥＩ－ｒＦＮ／ＣＤＨ－??（Ｃｈｉ－ｒＦＮ／ＣＤＨ）３）以后，随修饰层数增力口，接触角波动在３４°（ｒＦＮ／ＣＤＨ）或４５°（Ｃｈｉ），??接触角趋于稳定，提示层成分随修饰层数增加外层结构稳定改变，即己形成稳定的修饰??界面。由于修饰体系中缺乏其他可稳定存留与材料表面的成分，我们可以推测这是由于??材料表面被Ｃｈｉ或ｒＦＮ／ＣＤＨ均匀涂布的结果，早期修饰过程中接触角不规则变化可能??与最外层修饰大分子不能完全占据材料表面有关［３ｋ３３］。由于后期选择性富集及体内外实??验要求材料具有良好的稳定性，我们采用修饰１２层的材料作为实验的最终材料，即??－ＰＥＩ－ｒＦＮ／ＣＤＨ－?（Ｃｈｉ－ｒＦＮ／ＣＤＨ）?５
【参考文献】：
期刊论文
[1]Platelet-rich plasma for regeneration of neural feedback pathways around dental implants: a concise review and outlook on future possibilities[J]. Yan Huang,Michael M Bornstein,Ivo Lambrichts,Hai-Yang Yu,Constantinus Politis,Reinhilde Jacobs. International Journal of Oral Science. 2017(01)
[2]Application of platelet-rich plasma with stem cells in bone and periodontal tissue engineering[J]. Gabriela Fernandes,Shuying Yang. Bone Research. 2016(04)
[3]Use of demineralized bone matrix in the extremities[J]. Georgios I Drosos,Panagiotis Touzopoulos,Athanasios Ververidis,Konstantinos Tilkeridis,Konstantinos Kazakos. World Journal of Orthopedics. 2015(02)
本文编号：3582249
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