TSP-1修饰的BMSCs促进脊髓损伤大鼠功能康复的机制研究

发布时间：2024-04-22 21:53

　　目的:本研究构建了携带血小板反应素-1(Thrombospondin-1,TSP-1)基因的腺病毒,通过移植转染了携带TSP-1基因的腺病毒的骨髓间充质干细胞(Bonemarrow stem cells,BMSCs)到脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)部位,探讨 TSP-1 基因修饰的BMSCs(BMSCs+TSP-1)在脊髓损伤后运动功能恢复中的作用及其潜在机制。方法:首先进行目的基因序列的合成,通过双酶切获取目的基因片段,采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)以及基因测序技术对获取的目的基因片段进行鉴定,然后通过293细胞制备和扩增腺病毒。制备好的腺病毒转染BMSCs细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹鉴定转染效率和TSP-1的表达变化。细胞实验中,对脊髓前角运动神经元(Ventral spinal cord 4.1,VSC4.1)进行氧糖剥夺来模拟脊髓损伤后损伤部位神经元遭受的缺氧缺糖的微环境,将受损的神经元分别与不含细胞的培养基、正常的BMSCs、BMSCs + TSP-1进行共培养,通过免疫荧光和免疫印迹检测GAP-43...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１目的基因ＴＳＰ－１双酶切产物

３．１．目的基因片段的合成与纯化??合成目的基因序列，用Ｎｏｔｌ和ＥｃｏＲＩ双酶切基因获得ＴＳＰ－１片段，酶切完??成后胶回收。ＤＮＡ电泳结果显示种基因的扩增片段与标准序列完全一致（图１）。??用洁净的刀片在紫外线灯下将相应片段切取出来。并将胶块中无ＤＮＡ的胶块去除??掉，最后完....

图２?ＴＳＰ－１重组腺病毒质粒单克隆的ＰＣＲ鉴定

将转化后的ＴＳＰ－１平板进行挑菌，在３７°Ｃ下以２５０转／分钟的转速进行??摇菌］４小时，然后取菌液进行ＰＣＲ鉴定，单克隆ＰＣＲ鉴定连接产物与预期一致??（图２）。将阳性克隆菌液送上海桑尼生物技术有限公司测序，测序比对结果（图??３）显示合成序列与ＴＳＰ－１的序列完全一致。??２....

图４扩增病毒的细胞的形态

到１０ｃｍ的细胞培养皿中（细胞密度９０％以上），两天后，所有细胞脱落底面时进??行病毒收集，方法如上，然后取上清进行下一代病毒的扩增或者保存到－８０°Ｃ。之￥??后的病毒扩增及收集如上反复进行（图４Ｅ，Ｆ）。??２３??

图５腺病毒转染效果检测

图５腺病毒转染效果检测。Ａ为ＢＭＳＣｓ光镜照片，Ｂ为转染ＧＦＰ对照腺病毒的??ＢＭＳＣｓ，Ｃ为转染ＴＳＰ－１过表达腺病毒的ＢＭＳＣｓ，Ｄ为ＷＢ捡测ＴＳＰ－１的表迗情??况。??Ｆｉｇｕｒｅ?５?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ａｄｅｎｏｖｉｍｓ?ｔｒａｎｓ....

本文编号：3962271