慢病毒转GGCX基因对兔骨性关节炎软骨细胞的生物学影响

发布时间：2017-05-28 01:11

  本文关键词：慢病毒转GGCX基因对兔骨性关节炎软骨细胞的生物学影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:通过检测慢病毒介导的γ-谷氨酰基羧化酶(Vitamin K dependent gammaglutamyl carboxylase,GGCX)基因转染兔骨关节炎软骨细胞后对其凋亡的影响,以及对兔膝骨性关节炎的软骨细胞中MMP13、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的影响,探讨其对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞的作用。进而为体外骨性关节炎的基因治疗提供实验依据。研究方法:1、选取12只重量约(2.0±0.2)kg左右的日本雄性大耳兔,运用膝前交叉韧带切断的方法构建动物模型。对白兔进行6周饲养后处死,对兔膝关节的软骨细胞进行分离以及培养,最后运用Alcian Blue染色法以及Ⅱ型胶原纤维染色法对软骨细胞做鉴定。2、随机将软骨细胞分为三个组:空白对照组(不作任何处理)、阴性对照组(转染不含GGCX慢病毒的空载体)、转染组(转染含GGCX慢病毒)。检测转染成功后分别用q RT-PCR法及Western blot法检测各组中软骨细胞中GGCX、MMP13、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原m RNA及蛋白表达水平。3、运用Annexin V-FITCPI法来检测各个分组中软骨细胞的凋亡的情况。4、运用茜素红染色软骨细胞进行组织学检查。研究结果:1、兔骨关节炎的软骨细胞在初代中显现为扁平,多角不规则,有几个隆突,胞核为椭圆形,位于胞体中间。Alcian Blue染色软骨细胞表现天蓝色,Ⅱ型胶原纤维染色发现软骨细胞和胞外基质表现棕色或黄色。2、q RT-PCR检测结果示:GGCX在转染组中表达水平明显升高,MMP13在转染组中的表达水平明显降低,Ⅱ型胶原在转染组中表达明显升高,X型胶原在转染组中表达水平亦明显降低,差异有统计学意义(P0.05),阴性对照组以及空白对照组之间相比较未见显著差异(P0.05);W-B检测结果显示:GGCX在转染组中表达水平明显升高,MMP13在转染组中的表达水平明显降低,Ⅱ型胶原在转染组中表达水平明显升高,X型胶原在转染组中表达水平亦明显降低,差异有统计学意义(P0.05),阴性对照组以及空白对照组之间相比较未见明显的差异(P0.05)。3、运用Annexin V-FITCPI法检测各个分组凋亡率的结果显示:转染组总凋亡率为(17.833±2.612)%,与空白对照组总凋亡率(25.467±2.623)%以及阴性对照组总凋亡率(26.167±2.637)%相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),阴性对照组以及空白对照组相比较未见明显差异存在(P0.05)。4、茜素红染色结果显示:转染组中软骨基质深染,细胞数量多,可见少量钙结节,空白组和阴性对照组中软骨基质染色均一,大量钙结节形成。结论:1、采取前叉韧带切断大白兔的韧带能够成功造出白兔骨关节炎的模型,并能够成功分离培养出兔膝骨性关节炎的软骨细胞;2、慢病毒能成功介导GGCX基因转染兔骨性关节炎软骨细胞使其表达显著增加;3、转染含GGCX慢病毒能够使软骨细胞Ⅱ型胶原的表达显著增加;4、转染含GGCX慢病毒能够使软骨细胞MMP13、X型胶原的表达显著降低;5、转染含GGCX慢病毒后能够使骨性关节炎中软骨细胞的凋亡受到显著抑制;6、转染含GGCX慢病毒后能够使骨性关节炎钙结节形成受到显著抑制。
【关键词】：关节软骨 骨性关节炎 GGCX MMP-13 Ⅱ型胶原 X型胶原 免疫组织化学
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略词表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料与方法13-28
• 2.1 材料13-17
• 2.1.1 大耳兔13
• 2.1.2 软骨细胞13
• 2.1.3 慢病毒来源13
• 2.1.4 主要试剂和实验设备13-15
• 2.1.5 主要溶液的配制15-17
• 2.2 实验方法17-28
• 2.2.1 构建模型17
• 2.2.2 细胞分离培养17-19
• 2.2.3 软骨细胞的鉴定19-20
• 2.2.4 GGCX转染OA细胞20-21
• 2.2.5 qRT-PCR法检测基因表达21-23
• 2.2.6 Western-Blot法检测目的蛋白表达23-26
• 2.2.7 AV/PI（Annexin V-FITC & PI）染色分析细胞凋亡26
• 2.2.8 统计学处理26
• 2.2.9 茜素红染色软骨细胞26-28
• 第3章 实验结果28-36
• 3.1 构建兔OA模型28
• 3.2 细胞形态学观察和鉴定28-31
• 3.2.1 形态学观察28
• 3.2.2 软骨细胞鉴定28-31
• 3.3 qRT-PCR法检测GGCX、MMP13、Ⅱ型胶原、X型胶原mRNA表达31-32
• 3.4 Western-Blot检测蛋白32-34
• 3.5 细胞凋亡检测34
• 3.6 茜素红染色结果34-36
• 第4章 讨论36-39
• 第5章 结论与展望39-40
• 5.1 结论39
• 5.2 展望39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-43
• 综述 骨性关节炎的研究进展43-49
• 参考文献46-49

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