机械拉伸对血管平滑肌细胞增殖及凋亡影响的初步研究

发布时间：2017-07-17 15:22

  本文关键词：机械拉伸对血管平滑肌细胞增殖及凋亡影响的初步研究

  更多相关文章： 机械拉伸 血管平滑肌细胞 细胞周期 细胞增殖 凋亡 信号转导

【摘要】：研究背景本研究源自对大量临床现象的理性思考：机械应激是组织修复的重要因素,减轻机械应激可以减轻组织过度修复。皮肤修复过程中,关节活动区域的瘢痕面积常常较非关节区域的大：骨折断端由于固定不牢固常常会引起骨痂的大量增生,即组织过度修复,而骨折断端的绝对制动后极少或不引起骨痂形成。由此,本研究推断机械应激是影响组织过度修复的重要因素之._。本课题组前期研究发现：1、滴加α-氰基丙烯酸酯粘合剂可以减轻血管的过度运动；2、抑制血管的过度运动可以抑制血管内膜过度增生。许多学者研究机械应激对细胞的影响,研究范围广泛。本研究是在细胞及分子生物水平上探讨机械应激对细胞增殖、凋亡的影响,通过对大鼠胸主动脉平滑肌细胞施加机械拉伸力,检测在增殖及凋亡方面的变化,探索涉及的相关基因、蛋白及因子。目的为进一步在细胞生物学水平上验证机械应激可以导致组织过度修复,本研究利用Flexcell-5000T细胞拉伸装置,对大鼠胸主动脉平滑肌细胞施加机械拉伸力,通过调控拉伸力大小和拉伸时间,观察力学前后细胞在分子生物水平上的变化,检测涉及细胞增殖及凋亡的相关基因、蛋白及因子。方法(1)原代细胞提取及传代培养：对体重在200-220g的雄性SD大鼠胸主动脉取材,组织贴块法获取原代平滑肌细胞,传至3-8代用于后续实验。(2)细胞接受FX-5000T机械拉伸：将VSMCs以3x105个/ml的密度接种于Bioflex 6孔培养板上,拉伸强度范围0～30%,拉伸时间0～120min。实验组：A组5%;B组10%；C组15%;D组20%；E组25%；F组30%拉伸强度；对照组：0%；观察时间均为0,15,30,60,120min,频率均为1Hz。(3)通过流式细胞仪分析各组细胞周期,显微镜观察记录细胞形态,细胞计数仪计算细胞计数,MTT法分析细胞增殖,流式细胞仪分析各组细胞凋亡,RT-PCR分析细胞增殖相关基因：α-SMA,ERK,MMP-2,NF-κB,PCNA水平,Western blot分析相关蛋白水平,ELISA检测MCP-1、PDGF、TGF-β、VEGF细胞增殖相关因子的含量,分析细胞凋亡指标过氧化氢含量。结果(1)B组10%拉伸强度持续15min时细胞周期S期比例最高,为54.65%；F组30%拉伸强度持续60mmin细胞周期S期比例最低,为8.17%。与对照组相比,P0.05。(2)B组10%拉伸强度持续15min细胞计数最多,为5675x106；F组30%拉伸强度细胞计数最少,为2636x106。与对照组相比,P0.05。(3)B组10%拉伸强度在波长570nm测光吸收度值最高,为1.01；F组30%拉伸强度在波长570nnm测光吸收度值最低,为0.60。与对照组相比,P0.05。(4)E组25%拉伸强度持续60min时细胞凋亡比例最高,为25.64%；B组10%拉伸强度在0mmin细胞凋亡比例最低,为4.34%。与对照组相比,P0.05。(5)10%强度持续15mina-SMA相关mRNA水平为1.94；ERK相关mRNA水平为2.23;MMP-2相关mRNA水平为2.11；NF-κB相关mRNA水平为1.33；PCNA相关mRNA水平为1.56。10%强度持续15mina-SMA相关蛋白水平为8.73;ERK相关蛋白水平为3.68；MMP-2相关蛋白A水平为4.79;NF-kB相关蛋白水平为8.52；PCNA相关蛋白水平为8.52。10%拉伸强度持续15minMCP-1的含量为482.47pg/ml;PDGF的含量为345.31pg/ml;TGF-β的含量为4563.19pg/ml; VEGF的含量为5 0.03pg/ml。10%拉伸强度持续15min时过氧化氢数值最低,为4.20 uM。结论(1)10%强度拉伸持续15分钟显著提高细胞周期S期的复制比,促进细胞增殖,细胞计数增多；改变拉伸强度及时间影响细胞周期S期、细胞增殖、细胞计数。(2)25%强度拉伸持续60分钟显著促进细胞凋亡；改变拉伸强度及时间影响细胞凋亡。(3)10%强度拉伸持续15分钟,α-SMA, ERK, MMP-2, NF-kB, PCNA等细胞增殖相关基因和对应蛋白的表达水平较高；MCP-1、PDGF、TGF-β、VEGF因子等细胞增殖相关因子含量较高。
【关键词】：机械拉伸 血管平滑肌细胞 细胞周期 细胞增殖 凋亡 信号转导
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R654.3
【目录】：

• 中英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 引言13-16
• 实验部分16-54
• 1. 实验目的16
• 2. 实验材料16-17
• 2.1 实验动物16
• 2.2 实验试剂16-17
• 2.3 实验仪器17
• 3. 实验方法17-28
• 3.1 原代细胞提取及传代培养17-18
• 3.2 细胞接受Flexcell-5000T机械拉伸18-19
• 3.3 流式细胞术分析细胞周期19-20
• 3.4 细胞形态及细胞计数20
• 3.5 MTT法分析细胞增殖20
• 3.6 流式细胞术分析细胞凋亡20-21
• 3.7 RT-PCR分析细胞增殖相关基因21-23
• 3.8 Western blot分析细胞增殖相关蛋白23-27
• 3.9 ELISA检测细胞增殖相关因子含量27
• 3.10 过氧化氢含量检测27
• 3.11 统计学分析27-28
• 4. 实验结果28-50
• 5. 讨论50-54
• 结论54-55
• 参考文献55-59
• 文献综述59-71
• 参考文献65-71
• 攻读学位期间发表文章情况71-72
• 致谢72

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本文编号：554228