芍药苷诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬的发生

发布时间：2017-08-18 16:40

  本文关键词：芍药苷诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬的发生

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【摘要】：研究背景自噬是真核细胞中普遍存在的生命现象,自噬发生的重要特征为自噬体合成的增加,伴随着LC3-I(微管相关蛋白-轻链3-I,microtubule-associated protein 1 light chain3-I)向LC3-II(微管相关蛋白-轻链3-II,microtubule-associated protein 1 light chain 3-II)的转化的增加,因此,LC3-II/LC3-I的比值是评价自噬发生及自噬水平高低的一个重要指标。研究发现心脏、肺脏、肾脏等纤维化疾病中存在自噬不足现象,最近研究表明增生性瘢痕组织自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达水平较正常皮肤组织明显降低。增生性瘢痕病理特征主要表现为成纤维细胞过度增殖和细胞外基质大量合成及沉积,然而增生性瘢痕中成纤维细胞的自噬水平尚不清楚。已有研究发现自噬的发生能抑制心、肺、肾等纤维化疾病的纤维化进展,而自噬促进剂能明显抑制瘢痕成纤维细胞增殖、迁移,并明显减少α-SMA的表达。芍药苷(paeoniflorin,PAE)是传统中药芍药的主要单体活性成分。本课题组前期研究表明芍药苷能减少增生性瘢痕成纤维细胞中TGF-β1的自分泌和α-SMA的表达,从而抑制增生性瘢痕的发展,那么芍药苷是否会影响增生性瘢痕成纤维细胞的自噬发生?新近研究表明在瘢痕成纤维细胞中基质金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2)的表达增加可引起I型胶原表达的下降,相关研究发现在肾脏纤维化中TIMP-2表达的增加和自噬的发生存在正相关关系,而自噬促进剂能有效减少瘢痕成纤维细胞中I型胶原的表达。本课题组前期研究表明芍药苷能有效减少增生性瘢痕成纤维细胞中I型胶原的分泌,那么芍药苷能否调节TIMP-2的表达?是否能通过影响自噬的发生从而影响TIMP-2的表达?相关研究表明p38MAPK和ERK1/2与增生性瘢痕的发生、发展密切相关,那么p38MAPK和ERK1/2信号转导通路和芍药苷影响成纤维细胞自噬的发生之间是否存在关联?目的探讨芍药苷诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬的发生方法(1)收集增生性瘢痕组织及正常皮肤组织,采用组织块法分离培养增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞,在不加任何刺激因素的情况下,Western Blot检测两种细胞中基础条件下LC3和TIMP-2的表达情况;(2)分别加入不同浓度(0μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L)的芍药苷培养24h,Western Blot检测两种细胞中LC3、TIMP-2、p-p38MAPK、t-p38MAPK、p-ERK1/2和t-ERK1/2的表达情况;(3)加入400μmol/L的芍药苷分别培养0h、2h、6h、12h、24h、48h,Western Blot检测两种细胞中LC3的表达情况;(4)加入400μmol/L芍药苷,细胞培养24h,收集细胞,透射电镜观察细胞的自噬情况。结果(1)在不加任何刺激因素的情况下,增生性瘢痕成纤维细胞中LC3-II/LC3-I的比值较正常成纤维细胞明显降低(P0.01);(2)400μmol/L、800μmol/L的芍药苷能增加增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中LC3-II/LC3-I的比值(P0.05),而对增生性瘢痕成纤维细胞作用尤为显著(P0.01);(3)增生性瘢痕成纤维细胞中LC3-II/LC3-I的比值呈时间依赖性增加,24h达高峰;(4)未加任何刺激因素的增生性瘢痕成纤维细胞中未见自噬体和自噬溶酶体,而400μmol/L芍药苷处理细胞后,细胞胞浆内可见明显的自噬体和自噬溶酶体;(5)在不加任何刺激因素的情况下,增生性瘢痕成纤维细胞中TIMP-2蛋白的表达量较正常皮肤成纤维细胞明显升高;(6)增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中TIMP-2蛋白表达水平随着芍药苷浓度的增加呈浓度依赖性增加,其中400μmol/L、800μmol/L芍药苷对增生性瘢痕成纤维细胞影响显著(P0.01);(7)增生性瘢痕成纤维细胞中p-p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达较正常皮肤成纤维细胞中升高,而增生性瘢痕成纤维细胞中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表达在不同浓度芍药苷刺激后均有升高。结论(1)增生性瘢痕成纤维细胞的自噬水平较正常成纤维细胞降低;(2)一定浓度的芍药苷能诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬的发生;(3)一定浓度的芍药苷能增加增生性瘢痕成纤维细胞中TIMP-2的表达,而细胞自噬与TIMP-2高表达及胶原降解间的关系,需要进一步研究;(4)一定浓度芍药苷能增加增生性瘢痕成纤维细胞中p-p38和p-ERK1/2蛋白表达,而活化p38MAPK、ERK1/2与芍药苷增加增生性成纤维细胞自噬的作用之间的关系及其作用机制,需要进一步研究。
【关键词】：增生性瘢痕 自噬 微管相关蛋白-轻链3 芍药苷 基质金属蛋白酶抑制剂-2
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R622
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-13
• 第二章 实验材料及方法13-24
• 1. 实验试剂、耗材及仪器13-18
• 2. 实验方法18-23
• 3. 统计学分析23-24
• 第三章 实验结果24-33
• 1. HSFb和NSF细胞形态的差异24
• 2. HSFb和NSFb自噬相关蛋白LC3的表达情况24-25
• 3. 芍药苷对HSFb和NSFb中自噬相关蛋白LC3表达的影响25-28
• 4. 透射电镜观察增生性瘢痕成纤维细胞的自噬情况28-29
• 5. HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白的表达情况29-30
• 6. 芍药苷对HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白表达的影响30-31
• 7. 芍药苷对HSFb和NSFb中p38MAPK和ERK1/2 蛋白表达的影响31-33
• 第四章 讨论33-38
• 1. HSFb和NSFb的自噬相关蛋白LC3表达情况33-34
• 2. 芍药苷对HSFb和NSFb中自噬相关蛋白LC3表达的影响34-35
• 3. 透射电镜观察增生性瘢痕成纤维细胞的自噬情况35
• 4. 芍药苷对HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白表达的影响35-36
• 5. 芍药苷对HSFb和NSFb中中p38MAPK和ERK1/2 蛋白表达的影响36-38
• 第五章 结论38-39
• 参考文献39-43
• 中英文缩略词对照表43-44
• 攻读硕士期间取得成果44-45
• 致谢45

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本文编号：695636