嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路影响的研究

发布时间：2017-09-24 14:29

  本文关键词：嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路影响的研究

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【摘要】：肠动力不足(Intestinal motility deficiency,IMD)是重型颅脑损伤(Severe head injury,SHI)后常见的并发症。如果不能在早期进行有效的防治,可引起肠道菌群紊乱、加重机体炎症反应,甚至诱发多器官功能障碍综合征。目前临床用于防治IMD的药物均存在一定的副作用。近年来,益生菌在危重症患者治疗中的作用受到关注。研究表明,益生菌不仅能纠正严重创伤患者的肠道菌群失调,还具有改善肠动力的作用。但迄今大多数研究仅观察了用益生菌后的效果,对其改善肠动力相关机制的研究较少。平滑肌细胞的收缩舒张是肠动力的最终效应器,而钙依赖性通路是调控平滑肌细胞收缩的重要通路。当细胞受到外界刺激时胞外Ca~(2+)可经细胞膜上的Cav1.2钙离子通道流入细胞内,同时胞内钙库也会通过肌质网膜上的IP3R、RyR3释放部分Ca~(2+),使胞内游离的Ca~(2+)浓度升高,Ca~(2+)与Ca M、MLCK形成Ca~(2+)/Ca M/MLCK复合物,最终使MLC20磷酸化,引起平滑肌收缩。由此可见,MLC20的磷酸化水平与平滑肌细胞的收缩有密切的关系。此外,研究还发现PKC在调节MLC20磷酸化水平及肠道平滑肌收缩中也至关重要。课题组前期研究发现嗜酸乳杆菌可改善SHI小鼠肠道平滑肌的收缩功能,本研究在此基础上采用SHI小鼠肠动力不足模型,以调节肠道平滑肌收缩的钙依赖性通路为切入点,分别在给SHI小鼠灌胃嗜酸乳杆菌1d、3d、7d后观察其肠道平滑肌钙依赖性通路中信号分子的变化,初步揭示嗜酸乳杆菌改善SHI小鼠肠动力不足的可能机制。本课题旨在为嗜酸乳杆菌用于创伤领域提供实验证据,同时对探讨益生菌改善肠动力的相关机制提供参考依据。研究目的观察SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路信号分子的表达变化,明确嗜酸乳杆菌对伤后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路的影响,初步揭示嗜酸乳杆菌改善SHI小鼠肠动力不足的分子机制。实验方法本研究将90只健康雄性C57BL/6小鼠(18-24g)随机分为假伤组、损伤组和损伤+嗜酸乳杆菌组(每组30只)。每组小鼠均分为1d、3d、7d三个时相点(每一时相点10只小鼠)。各组小鼠均用5%的水合氯醛进行腹腔麻醉。损伤组和损伤+嗜酸乳杆菌组均采用改良的Feeney’s自由落体撞击法建立SHI后肠动力不足小鼠模型。假伤组只开骨窗,不进行打击。伤后约4h待小鼠清醒后开始灌胃。假伤组及损伤组小鼠灌胃0.5ml嗜酸乳杆菌培养基溶液,损伤+嗜酸乳杆菌组灌胃相同体积的嗜酸乳杆菌混悬液(约含菌1×1010CFU)。每天灌胃一次,其余时间均自由饮食水。分别在伤后1d、3d、7d留取末端回肠(距盲肠1.5cm)。蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测20KDa肌球蛋白轻链(MLC20)的磷酸化水平。酶联免疫吸附实验(ELISA)及免疫组织化学染色技术检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达量,ELISA检测MLCK的活性。ELISA检测PKC蛋白水平、L型钙离子通道Cav1.2、三磷酸肌醇受体(IP3R)、雷诺定受体(RyR3)的表达量。主要结果1.MLC20磷酸化水平变化Western blotting结果:与假伤组相比较,MLC20在SHI后1d、3d、7d的磷酸化水平均明显降低(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳杆菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠肠道平滑肌MLC20的磷酸化水平显著升高(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.05)。2.MLCK表达量及活性变化ELISA及免疫组化结果:MLCK在SHI后1d、3d、7d的蛋白浓度均明显低于假伤组(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳杆菌干预1d、3d、7d后MLCK的浓度均显著高于损伤组(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.01)。同时,伤后1d、3d、7d的MLCK活性均低于相同时相点假伤组MLCK的活性(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P0.01);嗜酸乳杆菌干预1d、3d和7d后MLCK的活性显著增强,且与损伤组相比差异有统计学意义(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.05)。3.PKC蛋白水平变化ELISA结果:SHI后1d、3d、7d的PKC水平明显高于假伤组相同时间点PKC的水平(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳杆菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠肠道平滑肌PKC水平显著降低(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.05)。4.Cav1.2表达量变化ELISA结果:SHI后第1d及损伤3d和7d后,小鼠肠道平滑肌Cav1.2的表达量均明显降低(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P0.01);嗜酸乳杆菌干预1d、3d和7d后Cav1.2的表达量均显著高于损伤组(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.01)。5.IP3R表达量变化ELISA结果:IP3R在SHI后第1d及伤后3d和7d的表达量均明显低于相同时相点假伤组IP3R的表达量(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P0.01);IP3R在嗜酸乳杆菌灌胃1d后的表达量虽有升高,但与损伤组相比差异无统计学意义(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d:P0.05),嗜酸乳杆菌灌胃3d和7d后SHI小鼠肠道平滑肌IP3R表达量显著提高(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,3d,7d:P0.01)。6.RyR3表达量变化ELISA结果:SHI后1d、3d、7d的RyR3表达水平均显著降低(损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P0.01);嗜酸乳杆菌灌胃第1d及灌胃3d和7d后RyR3蛋白水平均有升高,但与损伤组相比差异均没有统计学意义(损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P0.05)。结论1.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路信号分子的表达水平发生异常变化。2.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路中MLC20的磷酸化水平降低,MLCK的活性减弱、表达量下降。嗜酸乳杆菌可增强伤后MLCK的活性、提高MLCK的表达量及MLC20的磷酸化水平。3.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路中PKC的水平明显升高,嗜酸乳杆菌可降低伤后PKC的蛋白水平。4.SHI后小鼠肠道平滑肌钙离子通道Cav1.2、IP3R、RyR3表达量降低,嗜酸乳杆菌可提高伤后Cav1.2、IP3R、RyR3的表达水平。
【关键词】：重型颅脑损伤 嗜酸乳杆菌 钙依赖性通路
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 英文缩写表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-15
• 2. 材料与方法15-28
• 3. 结果28-36
• 4. 讨论36-42
• 全文总结42
• 创新点42
• 实验不足之处42-43
• 参考文献43-48
• 文献综述 L型钙通道结构与功能研究进展48-61
• 参考文献55-61
• 硕士期间撰写与发表的文章61-62
• 致谢62

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本文编号：911925