TIPE2诱导巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用

发布时间：2017-10-10 07:02

  本文关键词：TIPE2诱导巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用

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【摘要】：研究目的 动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种严重威胁到人类健康的慢性炎症性疾病,以动脉血管壁内膜血脂沉积、血管平滑肌细胞和纤维结缔组织增生、内膜的纤维性增厚以及粥样斑块的形成为主要特征,但其具体机制尚不明确。近年的研究表明,局部和全身性的免疫反应贯于动脉粥样硬化发病的全过程,伴随着由单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、淋巴细胞、肥大细胞及树突状细胞等组成的复杂细胞网络之间的交互作用。其中,作为固有免疫系统重要成员之一的单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化这一疾病的发生及发展过程中的作用非常关键。活化后的巨噬细胞可以通过分泌炎性细胞因子、基质金属蛋白酶等,对AS的发展起促进作用。此外,研究表明,巨噬细胞的凋亡在AS的发生、发展以及不稳定斑块的形成与破裂中发挥极其重要的作用。同时,巨噬细胞具有连接固有免疫与适应性免疫的桥梁作用,通过大量研究表明,巨噬细胞的凋亡发生于动脉粥样硬化的多个环节,对其机制的研究可为揭示动脉粥样硬化发生的分子机制以及利用免疫手段干预动脉粥样硬化的预防及治疗奠定良好基础。 TIPE2/,肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8-2(Tumor necrosis factor-a induced protein-8-like2)是2008年发现的新型抗炎免疫分子。研究发现,TIPE2可选择性表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官,此外尚可表达于具有内分泌功能的组织细胞、泌尿生殖细胞、造血细胞以及炎症组织中。研究发现,TIPE2-/-小鼠,会表现出脾脏肿大、体重下降以及白细胞增多等症状,并最终由于多器官发生炎症而导致死亡。同时,通过对慢性乙型肝炎患者的外周血检测发现,在患者的单个核细胞中,TIPE2表达下调,并与血清AST、ALT水平等呈负相关,说明TIPE2可能与乙肝的发生有密切关系。同时,通过对糖尿病肾病的研究发现,TIPE2肾小球中表达明显上调,说明TIPE2可能与糖尿病肾病的发生有密切关系。研究还发现,在SLE(系统性红斑狼疮)患者的外周血单个核细胞中,TIPE2表达被下调,同时,与病情的活动性指标之间存在负相关性,这些说明,说明TIPE2可能与系统性红斑狼疮的发生有密切关系。此外,TIPE2可通过负性调节机体的固有免疫及适应性免疫,发挥维持免疫稳态的作用。本课题组前期研究表明,TIPE2具有抗动脉粥样硬化作用,TIPE2基因缺失的巨噬细胞可抵抗LPS诱导的细胞死亡,这些现象提示TIPE2可能通过调节巨噬细胞的死亡影响动脉粥样硬化的发生以及发展过程。因为细胞凋亡和细胞自噬均可引起细胞死亡,为此,为明确TIPE2调控细胞死亡的确切分子机制,本课题开展了对TIPE2与巨噬细胞凋亡与自噬的研究。利用体外细胞试验系统地研究了动脉粥样硬化发生时TIPE2与巨噬细胞中凋亡相关分子的关系及TIPE2在巨噬细胞自噬中的作用,这为进一步研究动脉粥样硬化的免疫学机制提供了实验和理论依据,并且为动脉粥样硬化的预防及治疗提供新的靶点。 材料方法 1.腹腔巨噬细胞的诱导活化 取8-10周龄雄性C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-),腹腔注射6%的无菌淀粉,96小时后无菌分离取原代腹腔巨噬细胞,以含10%FBS的高糖DMEM培养基放于37℃,5%C02的培养箱中过夜培养,换液时,用无血清DMEM培养基洗涤一次,使未贴壁的巨噬细胞以及少量的红细胞被弃掉,保留贴壁的巨噬细胞,然后换含双抗的无血清DMEM培养基,静息24小时,然后加以含oxLDL的完全培养基刺激,分别检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的调控和巨噬细胞自噬的调控,检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的死亡受体通路、线粒体凋亡通路以及内质网应激(ERS)中相关基因转录的调控并对相关信号通路进行检测。 2.TIPE2对巨噬细胞死亡的调控 2.1检测TIPE2对巨噬细胞死亡的影响 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后用台盼蓝染色后,显微镜下观察拍照并做死亡细胞数量的百分比统计。 2.2.检测TIPE2对巨噬细胞自噬的影响 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,Western bolt以及real-time PCR分别检测LC3蛋白以及Atg5基因的表达。 2.3.检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的影响 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μ/ml的oxLDL刺激后用TUNEL染色后,显微镜下观察拍照并做凋亡细胞数量的百分比统计。 2.3.1细胞凋亡的检测 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,Annexin V/PI流式抗体孵育,用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡。 2.3.2TIPE2对巨噬细胞中caspase3活化的调控 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,Western bolt检测caspase3以及cleaved-caspase3蛋白的表达。 3.TIPE2对巨噬细胞中相关基因转录调控的检测 3.1TIPE2缺失巨噬细胞中外源性细胞凋亡通路的检测 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,提RNA后逆转录获得cDNA,用实时定量PCR的方法检测细胞凋亡相关分子Fas,cFLIP的基因表达。 3.2.TIPE2缺失巨噬细胞线粒体凋亡通路相关基因的检测 以上述上方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,提RNA后逆转录获得cDNA,用实时定量PCR的方法检测Bax,Bcl-2的基因表达。 3.3.TIPE2缺失巨噬细胞中内质网应激相关基因的检测 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,提RNA后逆转录获得cDNA,用实时定量PCR的方法检测CHOP,GRP78的基因表达。 3.4.TIPE2缺失巨噬细胞中其他凋亡相关基因的检测 以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxLDL刺激后收集细胞,提RNA后逆转录获得cDNA,用实时定量PCR的方法检测IAP2,TNFRSF12a的基因表达。 4.TIPE2对巨噬细胞相关信号通路的调控 取8-10周龄雄性C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-),腹腔注射6%的无菌淀粉,96小时后无菌分离取原代腹腔巨噬细胞,以含10%FBS的高糖DMEM培养基放于37℃,5%C02的培养箱中过夜培养,换液时,用无血清DMEM培养基洗涤一次,使未贴壁的巨噬细胞以及少量的红细胞被弃掉,保留贴壁的巨噬细胞,换含双抗的无血清DMEM培养基,静息24小时,然后加以oxLDL活化后收集细胞,Western bolt检测信号通路分子AKT, p-AKT蛋白的表达。 实验结果 1.TIPE2影响腹腔巨噬细胞的死亡 1.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞死亡细胞百分比下降 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞加以oxLDL刺激0,24,48h,分别用台盼蓝染色,镜下观察细胞,发现与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2缺失的腹腔巨噬细胞死亡率明显下降。 1.2TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞自噬水平升高 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞分别加50μg/mloxLDL刺激0,24,48h后收集细胞,Western blot检测LC3蛋白的表达,发现与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调,同时,0,24h后收集细胞, real-timePCR检测Atg5基因的表达,发现与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中,Atg5基因表达也同时明显上调。 1.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞凋亡水平降低 1.3.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞凋亡细胞百分比下降 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞加以oxLDL刺激0,24,48h,分别用Tunel染色,镜下观察细胞,发现与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2缺失的腹腔巨噬细胞凋亡细胞百分比显著下降。 1.3.2TIPE2基因缺失抵抗腹腔巨噬细胞的凋亡 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞加以oxLDL刺激0,24h,经AnnexinV/PI细胞凋亡试剂盒染色,经流式细胞术检测细胞凋亡率,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后巨噬细胞的凋亡率明显下降。 1.3.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞caspase3活化受抑制 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠TIPE2的腹腔巨噬细胞分别加50μg/mloxLDL刺激0,24,48h后收集细胞,Western blot检测caspase3及活化的caspase3(cleaved-caspase3)蛋白的表达,发现与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中,活化的caspase3蛋白表达明显下调,而caspase3蛋白的表达水平与对照组无显著性差异。 2.TIPE2对巨噬细胞中相关基因表达的影响 2.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中外源性细胞凋亡通路受抑制 oxLDL分别刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPEl2-/-)的腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测Fas,cFLIP的基因表达,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬细胞中,抗凋亡的cFLIP基因表达明显上调,但促凋亡的Fas基因表达下调,提示TIPE2基因缺失后外源性凋亡通路被抑制。 2.2TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中线粒体凋亡通路受抑制 oxLDL分别刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测Bax,Bcl-2的基因表达,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬细胞中,抗凋亡的Bcl-2基因表达上调,但促凋亡的Bax基因表达下调,提示TIPE2基因缺失后线粒体凋亡通路被抑制。 2.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬细胞中内质网应激水平下调 oxLDL分别刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPEX2-/-)的腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测CHOP,GRP78基因的表达,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后的巨噬细胞中CHOP,GRP78基因表达明显下调。 2.4TIPE2影响巨噬细胞中其他凋亡相关基因的表达 oxLDL分别刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测IAP2,TNFRSF12a基因的表达,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬细胞中,抗凋亡的IAP2基因表达上调,但促凋亡的TNFRSF12a基因表达下调。 3.TIPE2缺失的腹腔巨噬细胞AKT活化增强 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬细胞分别加50μg/mloxLDL刺激0,5,15,38min后收集细胞,Western blot检测AKT的活化情况,结果显示,与C57BL/6野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬细胞中,磷酸化的AKT表达增强,而AKT的表达水平与对照组无差异,说明TIPE2基因缺失后AKT信号通路活化增强。 结论 1.本课题进一步验证,TIPE2通过诱导巨噬细胞死亡发挥抗动脉粥样硬化作用； 2TIPE2通过调控外源性细胞凋亡通路、线粒体凋亡通路以及内质网应激等,发挥促进巨噬细胞凋亡的作用； 3.TIPE2促进巨噬细胞死亡的分子机制,可能与负性调节AKT的磷酸化有关； 4.此外发现,TIPE2基因缺失的巨噬细胞自噬水平升高,提示动脉粥样硬化发生中TIPE2具有抑制巨噬细胞自噬的作用,对动脉粥样硬化的效应有待进一步深入研究。 创新点及意义 1.首次研究了动脉粥样硬化发生中TIPE2与巨噬细胞凋亡的关系,提出TIPE2促进巨噬细胞凋亡的创新性论断； 2.课题通过C57BL/6野生型小鼠、TIPE2基因敲除小鼠以及细胞模型,深入研究了TIPE2正常表达的巨噬细胞与TIPE2基因缺失的巨噬细胞,在接受oxLDL刺激后,外源性细胞凋亡通路、线粒体凋亡通路、内质网应激反应以及AKT的活化差异,揭示TIPE2促进巨噬细胞凋亡的分子机制； 3.为进一步的研究提供了实验依据和理论依据,为寻找动脉粥样硬化免疫治疗的靶点提供了方向。
【关键词】：TNFAIP8L2 巨噬细胞 动脉粥样硬化 细胞凋亡 细胞自噬
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-21
• 符号说明21-23
• 前言23-26
• 技术路线26-27
• 材料和方法27-40
• 1. 实验材料27-29
• 1.1 实验动物和细胞27
• 1.2 主要试剂和耗材27-28
• 1.3 主要实验仪器28-29
• 2. 实验方法29-40
• 2.1 诱导与分离小鼠的腹腔巨噬细胞29-30
• 2.2 巨噬细胞死亡的检测30-31
• 2.3 巨噬细胞自噬的检测31-36
• 2.4 巨噬细胞凋亡的检测36-37
• 2.5 相关基因的检测37-38
• 2.6 检测AKT的活化38-39
• 2.7 统计学分析39-40
• 结果40-43
• 1. TIPE2基因缺失的巨噬细胞死亡率降低40
• 2. TIPE2基因缺失的巨噬细胞自噬水平升高40
• 3. TIPE2基因缺失的巨噬细胞凋亡水平降低40-41
• 4. TIPE2对巨噬细胞凋亡相关通路的影响41-42
• 5. TIPE2缺失的巨噬细胞AKT的活化增强42-43
• 讨论43-48
• 一、巨噬细胞与动脉粥样硬化43
• 二、TIPE家族及其生物学功能43-45
• 三、TIPE2与巨噬细胞凋亡45-48
• 结论48-49
• 附图49-54
• 参考文献54-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间主要科研成果60-61
• 学位论文评阅及答辩情况表61

【共引文献】

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