在体评价A20的缺失对GlcN诱导的血管保护的影响

发布时间：2017-10-12 02:26

  本文关键词：在体评价A20的缺失对GlcN诱导的血管保护的影响

  更多相关文章： A20 O-GlcNAc修饰 球囊拉伤 内膜增生

【摘要】：[目的]本研究旨在通过整体动物实验,对比分析A20的缺失对血管损伤后新生内膜形成的影响,探讨A20缺失对GlcN诱导的血管保护效应的影响。[方法](1)重组腺病毒的包装、扩增、有效性检测：①用脂质体转染的方法来包装AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP,并进一步扩增、收集腺病毒；②培养大鼠主动脉平滑肌并传代,用腺病毒接种大鼠主动脉平滑肌,荧光显微镜下观察效果,并提取细胞蛋白,检测A20蛋白含量,验证A20消减腺病毒的有效性。(2)构建大鼠左侧颈总动脉球囊拉伤模型及实验分组：健康雄性SD大鼠,体重为350-400克,72只,随机分为3大组,每组24只;① AD-shA20组(球囊拉伤左侧颈总动脉+转染AD-shA20-eGFP);② AD-NULL组(球囊拉伤左侧颈总动脉+转染AD-NULL-eGFP);③生理盐水组(球囊拉伤左侧颈总动脉+生理盐水)。每大组分为两种不同的处理：Vehicle组,GlcN治疗组。大鼠用氯胺酮(80mg/kg)及赛拉嗪(5 mg／kg)联合腹腔注射麻醉,取颈部正中切口,钝性分离皮下组织,暴露颈总动脉、颈内和颈外动脉的分叉处,分离左侧颈外动脉至远心端1cm,用显微血管夹夹闭左侧颈总动脉的近心端及颈内动脉,以暂时性地阻断血流,并用手术缝线结扎颈外动脉的远心端；在左侧颈外动脉剪一小切口,将2F Fogarty球囊导管沿颈外动脉的切口插入并送至左颈总动脉,用50微升的生理盐水充盈球囊,来回抽动3次来剥脱颈总动脉内膜。退出球囊后,向颈总动脉损伤血管的节段内缓慢灌注相应的灌注液AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP、生理盐水0.5ml并浸泡血管,局部作用约30分钟后吸出,并恢复血流。AD-shA20+GlcN治疗组、AD-NULL+GlcN治疗组以及生理盐水+GlcN治疗组术后即刻给予GlcN (0.3mg·g-1·day-1 ip),连续注射14d。(3)术后第5天取每组大鼠3只,取出左侧颈总动脉损伤节段,做冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的含量,藉以评估AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP的转染效率。(4)术后第14天取各组左侧损伤的颈总动脉以及右侧作为对照,做石蜡切片进行HE染色,进行内膜增生的形态学分析；(5)用WB法检测左侧球囊损伤血管壁组织的A20, P-P65, O-GlcN的表达水平。[结果](1)在转染AD-shA20的RASMCs, A20蛋白表达明显减少,表明AD-shA20-eGFP具有消减A20的作用,包装的腺病毒有效。(2)荧光显微镜下观察冰冻切片,可以见到血管内膜及中膜有大量绿色荧光分布,证明球囊拉伤血管AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP转染成功。(3)大鼠颈总动脉球囊损伤术后14d,各组大鼠的左侧颈动脉内膜跟右侧未拉伤的血管相比,内膜均有不同程度的增生,证明球囊拉伤手术成功。AD-NULL组和生理盐水组,增加机体的O-GlcNAc修饰水平后,新生内膜的增生明显受到抑制；AD-shA20组,增加体内的O-GlcNAc修饰水平,对新生内膜的增生的抑制作用明显减弱；且AD-shA20组在不增加O-GlcNAc修饰水平的情况下,新生内膜增生的情况比其他组更显著。(4)各组的G1eN处理后,O-GlcNAc修饰水平均明显提高,各组A20表达略微升高；AD-NULL组和生理盐水组提高O-GlcNAc修饰的水平可以抑显著制P-P65的表达；AD-shA20组,A20蛋白的表达明显降低,且提高O-GlcNAc修饰水平不能再明显抑制P-P65的表达；AD-shA20组在不升高O-GlcNAc修饰水平的情况下(Vehicle处理),与其他组相比,P-P65的表达显著升高。[结论]1.大鼠颈动脉球囊损伤后局部转染AD-shA20可以降低局部组织A20的表达。2.提高机体的O-GlcNAc修饰水平,对球囊拉伤后血管新生内膜的增生有抑制作用。3.A20的缺失可以削弱GlcN对球囊拉伤后血管新生内膜的保护作用。
【关键词】：A20 O-GlcNAc修饰 球囊拉伤 内膜增生
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-8
• 中英文对照缩略词表8-9
• 前言9-12
• 材料与方法12-25
• 结果25-32
• 讨论32-37
• 结论37-38
• 参考文献38-43
• 综述43-56
• 参考文献51-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士学位期间发表论文目录57-58

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本文编号：1016129