血小板GPIb受体拮抗剂Agkisacucetin对人血小板聚集和释放反应影响的研究

发布时间：2017-10-16 19:37

  本文关键词：血小板GPIb受体拮抗剂Agkisacucetin对人血小板聚集和释放反应影响的研究

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【摘要】：目的:血小板黏附和聚集在动脉粥样硬化基础上的血栓形成中起重要的作用,而血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)受体与血管性血友因子(VWF)相互作用是血小板黏附、聚集及血栓形成的始动环节,同时也是高剪切力下血小板在血管病理性狭窄部位发生黏附和聚集的重要机制。因此,GPIb-VWF交联轴被认为是抗血栓治疗的重要靶点。Agkisacucetin是一种全新的抗血小板制剂,为一种提纯于蛇毒的蛋白质,主要通过拮抗GPIb受体与VWF相互作用而发挥抗血小板黏附和聚集作用,在动物实验中显示有强大的抗血小板黏附、聚集以及抗血栓形成的功能,目前处于初期临床试验阶段。本研究旨在:1)在体外实验,通过观察Agkisacucetin对于不同致聚剂下人血小板最大聚集率(the maximal platelet aggregation,rPA,max)的抑制作用,探讨其对于人血小板聚集的影响;2)在体外实验,通过观察Agkisacucetin对于人血小板CD62p的表达的作用,探讨其对于血小板释放反应的影响,为其初期临床试验提供参考依据。方法:选择2014年3月至2014年12月于我院体检中心体检的健康志愿者50人,清晨空腹取肘静脉血,分离得到富血小板血浆(PRP)。接下来将实验分为两个部分:1、实验第一部分,探讨Agkisacucetin对于人血小板聚集反应的影响,首先检测瑞斯托霉素(终浓度:1mg/ml)、二磷酸腺苷(ADP,终浓度5μmol/l)诱导的血小板最大聚集率(rPA,max),分别作为对照组,然后检测检五种浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/ml,下同)Agkisacucetin干预这两种致聚剂诱导下的血小板聚集的最大聚集率的表达,分别作为试验组,比较试验组与相应的对照组之间rpa,max的差异,即agkisacucetin干预前后的致聚剂诱导血小板聚集的最大聚集率的差异,进行方差分析;以及比较agkisacucetin对于rpa,max的抑制与药物浓度之间的关系,进行线性回归分析。此部分实验在血小板聚集仪上操作。2、实验第二部分,探讨agkisacucetin对于人血小板释放反应的影响,此部分实验分别有三组分组实验:第一组分组实验,检测静息血小板(不加任何试剂)cd62p的表达,作为空白对照组,adp与瑞斯托霉素分别作为不同的处理因素干预血小板,检测它们处理血小板后血小板cd62p表达,作为两试验组,比较试验组与空白对照组之间结果的差异,以及两试验组之间的差异,进行方差分析。第二分组实验,静息血小板的cd62p表达作为空白对照组,adp处理后血小板的cd62p表达结果作为阳性对照组,检测五种浓度分别直接作用于血小板后血小板cd62p的表达,此五组分别作为试验组,比较试验组与空白对照组之间差异以及试验组与阳性对照之间的差异,进行方差分析;并探讨试验组cd62p表达结果与药物浓度之间的关系,进行线性回归分析。第三组分组实验,以静息血小板cd62p的表达作为空白对照组,adp处理的血小板cd62p表达作为阳性对照组,检测五种浓度agkisacucetin分别干预adp处理的血小板后cd62p的表达结果,作为试验组,比较试验组与空白组之间的差异,以及试验组与阳性对照之间的差异,进行方差分析,并探讨试验组与阳性对照组之间的差值与药物浓度之间的关系,进行回归分析。结果:1、瑞斯托霉素诱导血小板后,血小板发生聚集,其中rpa,max为85.26±8.25%,五种浓度的agkisacucetin对瑞斯托霉素诱导的血小板最大聚集率(rpa,max)均低于相应的对照组,各组之间差异有统计学意义(p0.05),且随着agkisacucetin浓度的增加,对血小板聚集的抑制率也随之增加,两者之间呈正相关(r=0.936,p0.01),其中药物半最大效应浓度(concentrationfor50%ofmaximaleffect,ec50)在2.0μg/ml左右。2、adp诱导血小板后,血小板发生同样聚集,其中rpa,max为63.23±8.12%,分别而对adp诱导的血小板最大聚集率结果与之相应的对照组相比,rpa,max的表达无明显差异(p0.05),其中agkisacucetin对于adp诱导的血小板最高抑制率为3.05±0.39%。3、正常人静息血小板CD62P表达率为(6.56±2.91)%,瑞斯托霉素激动后的表达率为(10.81±4.50)%,两组比较无显著差异(P0.05),而ADP激动后的表达率为(68.82±6.02)%,表达率明显高于静血小板的,差异有统计学意义(P0.05),瑞斯托霉素试验组的CD62p表达率明显低于ADP试验组的,差异有统计学意义(P0.05)。4、五种浓度的Agkisacucetin单独作用于血小板后CD62p的表达分别与静息血小板的相比均略有升高,最高浓度(8.0μg/ml)作用下血小板CD62p的表达为11.07±3.26%,五种浓度组分别与静息血小板CD62p的表达相比差异无统计学意义(P0.05),而分别于阳性对照相比,结果明显明显较低,差异有统计学意义(P0.05),随着Agkisacucetin浓度升高,CD62p表达有逐渐升高趋势,最各浓度之间进行两两比较,差异无统计学意义(P0.05)。5、五种浓度的Agkisacucetin作用于ADP诱导的血小板CD62P表达结果与阳性对照相比略有升高,五种浓度试验组分别与ADP阳性组相比,差异无统计学意义(P0.05),随着Agkisacucetin浓度的升高,与阳性组之间差值的绝对值之间有升高趋势,中最高浓度组的CD62p表达为72.13±5.26%,与阳性对照组差值的绝对值为3.25±1.02%。方差分析结果,差值绝对值之间差异无统计学意义(P0.05。结论:Agkisacucetin能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,其抗血小板聚集作用与药物浓度呈正相关,其中EC50在2.0μg/mL附近,而ADP诱导的血小板聚集却无明显抑制作用。Agkisacucetin对血小板CD6p表达无抑制作用,其本身对血小板CD62p表达的影响较小,即与其抗血小板聚集作用相比,其对血小板释放反应影响较小。
【关键词】：血小板膜糖蛋白Ib受体拮抗剂 Agkisacucetin 血小板最大聚集率 CD62P
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-20
• 材料（资料、内容）与方法20-29
• 1. 主要试剂与仪器20-21
• 1.1 试剂20
• 1.2 仪器20
• 1.3 相关制剂配置20-21
• 2. 标本来源21
• 3.实验方法21-25
• 技术路线图25-29
• 结果29-38
• 讨论38-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-70
• 参考文献63-70
• 作者简介及读研期间主要科研成果70-71
• 致谢71

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