应用斑马鱼模型验证先心病关联SNP位点的功能

发布时间：2017-10-21 08:50

  本文关键词：应用斑马鱼模型验证先心病关联SNP位点的功能

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【摘要】：先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)已经成为目前世界上最常见的出生缺陷,是围产期死亡和婴儿死亡的主要原因。据统计,约28%的先天畸形存在心脏缺陷。流行病学显示,全世界的先天性心脏病发病率约为1000个新生儿中有8例患儿,1000个成人中有4例先天性心脏病患者。此外,先天性心脏病患者通常需要长期的治疗,给病人、亲属和家庭造成极大的经济负担和精神痛苦。在过去的十年中,动物模型的研究已帮助阐明了早期心脏发生和分化的过程中的基本通路,并且揭示了某些种类的先天性心脏病的遗传基础,为心脏发育以及心脏发育失调导致先天心脏畸形提供了一些机制上的启示。流行病学研究表明,约20%的先天性心脏病是综合征型,比如我们所熟知的Holt-Oram综合征,包括先天性心脏畸形和肢体异常,可以发现存在基因TBX5的突变,还有DiGeorge综合征,包括先天性心脏病和腭裂,存在基因TBX1的部分缺失等等。其余是非综合征型先天性心脏病。和综合征型先天性心脏病相比,大多数非综合征型先天性心脏病是散发的,并且可能由多因素所导致的,比如多个低外显率的易感基因的突变或者暴露于各种不利的环境因素造成的突变。尽管如此,人们对于大多数散发的先天性心脏病的病例研究却少之又少,这就往往忽略了一些低外显率的易感基因突变。为了找到散发的非综合征相关的先天性心脏病和常见基因突变之间的联系,本实验室前期针对大量先心病样本,进行了多级全基因组关联研究,一共发现了53个单核苷酸的多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)相关位点(P10-5),在其所在处及左右500kb范围内找到60个人易感基因,其中包括已知的TBX3对心脏发育有明确作用,一共有32个基因与斑马鱼一对一同源。为了验证我们根据SNP相关位点所找出的易感基因是否对胚胎心脏发育有影响,我们使用斑马鱼作为研究模型,将与斑马鱼同源的基因,设计合成吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(Morpholino,MO)。我们一共设计成功29个MO。MO在细胞内通过与m RNA结合,阻断mRNA前体的剪辑或mRNA的翻译过程,使得目的基因功能受到抑制。我们将其显微注射到1-4细胞期的斑马鱼胚胎中,通过观察有绿色荧光标记的心脏,分析候选易感基因阻抑后对胚胎发育,尤其心脏表型和功能的影响。结果显示,GWAS筛选出的人类先天性心脏病候选易感基因中,grm4、iqgap2、tbx15、slc24a3、ptpn22、tbck和tbx3,他们在斑马鱼中的同源基因缺失会导致斑马鱼胚胎心脏出现多种异常的表型,包括心房心室大小异常、心搏减弱,心率减慢、环化不完全、严重者心脏发育呈管状。说明GWAS筛选出的候选基因中,有一部分在斑马鱼的胚胎发育过程中,确实对心脏发育具有重要作用,为进一步阐明人类先天性心脏病的发病机制提供了很好的研究工具。
【关键词】：出生缺陷 先天性心脏病 斑马鱼 胚胎发育
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 前言8-12
• 实验材料与方法12-17
• 一、实验材料12-15
• 二、实验方法15-17
• 实验结果17-33
• 一、筛选基因17-22
• 二、注射后胚胎存活率22-25
• 三、心脏异常25-33
• （一） 心脏环化异常27-28
• （二） 心脏大小异常28-30
• （三） 心脏瓣膜异常30-31
• （四） 心率异常31-33
• 讨论33-42
• 参考文献42-50
• 文献综述50-66
• 综述参考文献59-66
• 附录66-67
• 致谢67

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本文编号：1072405