α1A和AT1受体通过特定PKC亚型调节hERG钾通道的分子基础

发布时间：2017-11-02 00:00

  本文关键词：α1A和AT1受体通过特定PKC亚型调节hERG钾通道的分子基础

  更多相关文章： GPCR PKC亚型 p-PKC? p-PKCε ?1A受体 AT1受体 HERG钾通道

【摘要】：心律失常,尤其是严重的室性心律失常,是致心血管病患者死亡的主要原因之一。揭示心律失常发生的细胞分子机制,对于心血管疾病治疗有重要意义。先天遗传基因改变或后天获得性因素引起心肌离子通道的结构和/或功能紊乱是产生心律失常的重要分子基础[1-5]。其中获得性离子通道功能的改变与神经体液系统的过度激活(特别是交感肾上腺素和肾素-血管紧张素-醛固酮系统)密切相关。已有大量文献报道,肾上腺素?1A受体和血管紧张素II(Ang II)AT1受体可调节心肌细胞膜上的离子通道功能,是心血管疾病病理情况下通道功能异常的重要原因[6-10]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)作为细胞功能调控的重要分子,中介多种神经体液因子作用,在离子通道功能调节中发挥重要作用[11-19]。依据PKC结构与激活机制分为三类:传统型PKC(c PKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(n PKC,包括δ、ε、π和θ),非典型PKC(a PKC,包括ζ、?/λ)。已知不同动物种属的心肌组织均存在PKCα、βI、βII、γ、ε、?、?等亚型,尤其富含PKC?和PKCε亚型[20-22]。有研究表明,对通道动力学不同的调控方式提示可能不同的PKC亚型中介两种G蛋白偶联受体的作用[23-30],肾上腺素?1A受体和血管紧张素II(Ang II)AT1受体激动均可通过PKC信号通路调控心脏HERG钾通道功能[24,31-33]。因此,本研究主要用分子生物学方法,在稳定表达HERG钾通道的HERG-HEK293细胞,以及成年豚鼠心脏,分给予A61603(?1A受体激动剂)、AngⅡ(AT1受体激动剂),测定受体激动后不同亚型磷酸化PKC含量变化(PKC自身的磷酸化为其活化的表现),确定PKC激动的亚型特异性。利用免疫共沉淀(Co IP)方法进一步分析激活的PKCε、PKCα与HERG钾通道的空间关系,为两种G蛋白偶联受体通过不同亚型PKC调节HERG钾通道功能提供分子生物学实验基础。目的:利用特异性磷酸化PKC抗体检测?1A和AT1受体激动后不同PKC亚型的活化以及其与HERG钾通道的关系方法:在稳定表达HERG钾通道c DNA的HERG-HEK293细胞上瞬转?1A或AT1受体后,分别加入A61603或AngⅡ10分钟后,提细胞膜蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳完成后将蛋白转移至PVDF膜上,5%BSA封闭液封闭2小时后,依次加入特异性p-PKC?(磷酸化PKC?抗体),p-PKCε(磷酸化PKCε抗体)和GAPDH(内参蛋白)一抗过夜后,洗膜孵荧光二抗,用Odyssey 9120双色红外激光成像系统仪器扫描,分析蛋白条带,检测目的蛋白表达的变化。目的蛋白的相对含量以目的蛋白与其GAPDH的灰度值比值表示,并均以对照组的灰度比值1,计算出给药后目的蛋白表达量的变化。用Origin Pro 7.5进行数据分析,采用平均数±标准误表示,实验重复次数用n表示。采用t检验进行组间数据比较,当P0.05时,认为组间的差异有统计学意义。使用豚鼠左心室心肌组织重复以上实验。完整豚鼠心脏快速取出后,置Langendorff灌流装置,台氏液灌流待稳定后,灌流A61603或AngⅡ10分钟,提取左心室组织膜蛋白做Western Blot,检测磷酸化PKC?和PKCε含量,数据处理同上。为验证磷酸化PKC?和PKCε与HERG钾通道的关系,做免疫共沉淀(Co IP)实验。依次完成裂解,沉淀,预清除,抗体混悬过夜,加琼脂糖珠,洗脱等步骤,将所得蛋白液进行Western Blot实验,检测HERG钾通道蛋白,p-PKC?和p-PKCε。结果:1?1A和AT1受体激动后,不同PKC亚型的活化Western blot结果显示,在稳态表达HERG-HEK293细胞,?1受体激动剂A61603(1μM)处理细胞明显提高p-PKC?表达量,约为control组的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKC?含量变化与PKC激动剂PMA相近,然而,A61603并不影响p-PKCε的含量;豚鼠心脏灌流A61603后,p-PKC?蛋白含量为control组的1.1(P0.05,n=3)倍;p-PKCε含量虽有变化,但无统计学意义。以上实验表明,?1A受体激动剂可选择性激活PKC?亚型。HERG-HEK293细胞瞬转AT1受体,加入AngⅡ(100n M)孵育后,Western blot结果显示p-PKC?含量约为control组的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKCε蛋白含量约为control组的1.2倍,表达变化与PMA相近;豚鼠心脏灌流AngⅡ后,左心室组织膜蛋白p-PKC?蛋白含量约为control组的1.2倍(P0.05,n=3),p-PKCε蛋白含量为control组的1.3倍(P0.05,n=3),AngⅡ对p-PKC?,p-PKCε蛋白表达的变化均与PMA相似。以上实验表明,AT1受体激动剂可以选择性的激动PKC?和PKCε,且对PKCε的激动作用更强。2激活的PKC?和PKCε与h ERG钾通道的相互关系。豚鼠心脏灌流A61603或AngⅡ后,左心室组织做Co IP实验验证蛋白-蛋白相互作用。实验结果显示,用特异性抗体免疫沉淀HERG蛋白后,Western blot显示p-PKC?和p-PKCε蛋白条带均呈阳性;提示p-PKC?、p-PKCε与HERG通道共定位在细胞膜上。结论:1?1A受体激动剂可以选择性的激动PKC?;而对PKCε,?1A受体激动剂未见明显作用;AT1受体激动剂可以同时激动PKC?与PKCε,但激动程度有一定差异,在豚鼠心室组织对PKCε作用更强。2免疫共沉淀实验提示,p-PKC?和p-PKCε与HERG通道蛋白存在共定位现象,提示激活的PKC?和PKC可能直接调控通道功能。
【关键词】：GPCR PKC亚型 p-PKC? p-PKCε ?1A受体 AT1受体 HERG钾通道
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-23
• 结果23-24
• 附图24-32
• 附表32-34
• 讨论34-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述 内吞作用对心脏电压依赖钾通道的调节40-50
• 参考文献46-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 颜铮;钾通道启开剂药理的最新进展[J];药学进展;1994年03期

2 张永昶;肺动脉平滑肌细胞膜钾通道的细胞内调控[J];国外医学.呼吸系统分册;2000年04期

3 张炜,王晓良;钾通道家族新成员:双孔道钾通道的研究进展[J];生理科学进展;2003年01期

4 彭盛德,胡霞敏,曾繁典;ATP敏感钾通道——一种心肌缺血的防御机制[J];湖北民族学院学报(医学版);2003年01期

5 伍吉云;钾通道特性的研究进展[J];井冈山医专学报;2003年04期

6 黄元伟;钾通道与心血管临床[J];岭南心血管病杂志;2003年02期

7 刘彩连,张惠斌,黄文龙;钾通道调节剂的研究进展[J];药学进展;2003年04期

8 黄元伟;钾通道与心血管临床[J];心脏杂志;2004年02期

9 徐春华;刘远厚;;钙激活钾通道α单位的研究现况[J];医学综述;2006年23期

10 段燕红;陈付学;;ATP敏感钾通道的结构、功能及其调制[J];医学分子生物学杂志;2007年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 杨瑞玲;刘宏;;钾通道对平滑肌收缩调控影响的研究进展[A];2013年全国医药学术交流会暨临床药学与药学服务研究进展培训班论文集[C];2013年

2 张世忠;曹阳;;线粒体钙激活及ATP敏感钾通道在肢体远距预处理心肌保护中作用研究[A];中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集[C];2010年

3 曹嵩;喻田;;线粒体ATP敏感性钾通道与心肌缺血-再灌注损伤研究进展[A];全国第四次麻醉药理学学术会议暨2013年贵州省麻醉学术年会论文汇编[C];2013年

4 钱霞;孔辉;周芳;牛玲;丁建花;孙秀兰;范益;胡刚;;ATP敏感性钾通道:抗抑郁治疗的新靶点[A];中国药理学会第十次全国学术会议专刊[C];2009年

5 韩圣娜;张莉蓉;胡香杰;范天黎;;氟康唑对HERG钾通道电生理功能的影响[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年

6 何华美;汪海;肖文彬;;依普卡林对血管平滑肌ATP敏感性钾通道的调节[A];海峡两岸三地药理学学术报告会论文汇编[C];2001年

7 杨国勋;李志;刘唐威;钱静;农丹鹏;;四乙胺阻断大电导钙激活钾通道对血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制研究[A];中华医学会第十五次全国心血管病学大会论文汇编[C];2013年

8 魏晓莉;孙洪良;华南;张诚;闫海涛;郑建全;;ZC88阻断HERG钾通道抑制肿瘤细胞增殖[A];2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2011年

9 尹莹;田申;杨波;夏强;;睾酮替代疗法通过促进线粒体ATP敏感性钾通道开放发挥心肌保护作用[A];浙江省生理科学会2006年学术年会论文汇编[C];2006年

10 李宝馨;杨宝峰;;基于HERG钾通道,靶向性研究心律失常发生及药物干预的机制[A];中国化学会第八届天然有机化学学术研讨会论文集[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 付东红;学者揭示钾通道结构与功能[N];健康报;2007年

2 吕工;ATP敏感钾通道及其相关药物研究[N];中国医药报;2002年

3 周勇;北大医学部揭示钾通道结构基础和分子机制[N];中国医药报;2007年

4 衣晓峰 陈英云;哈医大钾通道药理学研究获系列进展[N];中国医药报;2007年

5 ;钾离子通道药物作用的新靶点[N];中国医药报;2003年

6 成银霞;外周镇痛药作用新机制：激活精氨酸/NO/cGMP/蛋白激酶G/ATP敏感性钾通道 Analgesics:Stimrlators of the NO-cGMP-PKG-K+ ATP Channel[N];中国医药报;2006年

7 吕工 编译 林;心有灵药一点通[N];医药经济报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 康劲松;淋巴细胞钾通道在应激引起的神经免疫调节变化中的作用[D];吉林大学;2005年

2 孙洪良;4-氨基哌啶类化合物ZC88抗肿瘤活性及机制的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

3 王国勇;高血压时阻力血管平滑肌钙激活钾通道的特性及调节[D];中国协和医科大学;1994年

4 张鹏俊;钾通道介导Aβ的神经毒及HN的拮抗作用：电生理和凋亡的实验观察[D];山西医科大学;2009年

5 赵宁;Kv1.3钾通道阻断药物对人T淋巴细胞活化的调节及意义[D];华中科技大学;2014年

6 佟倩;ACEI诱导的延迟心肌保护作用及与ATP敏感钾通道的关系[D];吉林大学;2004年

7 袁辉;延迟整流钾通道Kv2.1在氧糖剥夺介导细胞损伤中的作用及相关药理学研究[D];中国协和医科大学;2009年

8 李志松;κ阿片受体激动剂U50488对未分化PC12细胞钾通道的调节作用及其机理的初步探讨[D];中国协和医科大学;2006年

9 何彦林;新型抗抑郁药物调节小鼠皮层神经元钾通道的新机制[D];复旦大学;2012年

10 杨林杰;ClC-3氯通道和IK1钾通道在细胞容积调节和迁移中的作用[D];暨南大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 申丽;α1A和AT1受体通过特定PKC亚型调节hERG钾通道的分子基础[D];河北医科大学;2015年

2 贾秀芹;钾通道调控药对点燃模型的作用及其机制[D];青岛大学;2007年

3 刘树楷;蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12与心脏HERG钾通道相互作用并调控通道功能的研究[D];汕头大学;2011年

4 丁捷;钙激活钾通道及ATP敏感性钾通道在缺氧性肺血管收缩中的作用[D];华中科技大学;2006年

5 刘冲;针对HERG钾通道的早期心脏毒性评价的高通量筛选细胞模型[D];郑州大学;2012年

6 张邱兵;新疆哈萨克族高血压病患者外周血T淋巴细胞钾通道药物干预的实验研究[D];新疆医科大学;2014年

7 石金山;缺氧/药物后处理对大鼠心肌细胞ATP敏感性钾通道亚基的影响[D];遵义医学院;2010年

8 余宏;FHL2对突变型HERG钾通道的调控作用及其机理的研究[D];南方医科大学;2014年

9 卢安东;内毒素对新生大鼠延髓呼吸中枢神经元ATP敏感钾通道的影响及其机制研究[D];第二军医大学;2010年

10 毛讯;氟康唑对hERG钾通道电生理功能的影响[D];郑州大学;2010年

，

本文编号：1129060