蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

发布时间：2017-11-05 07:04

  本文关键词：蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

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【摘要】：背景:缺血性心脏病(IHD)是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,其病理改变是缺血区心肌细胞因缺血缺氧而坏死,梗死区逐渐被纤维疤痕所替代,残余心肌则代偿性肥厚,发生心室重构,而心室重构正是造成心梗患者顽固性心力衰竭和死亡的主要原因,虽然药物及介入等治疗手段发展日新月异,但目前仍无法从根本上逆转心室重构及后续的心力衰竭。骨髓间充质干细胞(BMSCs)可促使心肌细胞分裂及再生,修复病变的心肌组织,并维持心脏的自稳态,改善心脏功能,BMSCs移植已作为治疗心衰的一种手段。近年来大量研究发现:BMSCs在心肌组织修复过程中存在迁移。反应性BMSCs是如何迁移到病变心肌组织的,目前已有大量研究表明趋化因子及蛋白磷酸激酶参与BMSCs的迁移,而蛋白磷酸酶对BMSCs的迁移作用方面的研究报道尚少。目的:研究蛋白磷酸酶2A(PP2A)对本底水平及SDF-1/CXCR4轴介导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移的调控;探寻SDF-1/CXCR4轴介导的BMSCs迁移过程中可能发挥作用的PP2A功能性调节亚基。方法:本实验以体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)为研究模型,采用PP2A的特异性抑制剂,并结合脂质体转染技术导入si RNA,从不同的角度调节PP2A的活性,并采用划痕实验和Transwell迁移小室实验评价PP2A对BMSCs迁移的调控作用。(1)划痕实验(wound-healing):分别用12孔板培养不同处理的各组细胞,每孔接种细胞数控制为1.0×105/ml,进行划痕实验,在显微镜下观察划痕修复的过程,比较不同处理组细胞水平运动能力的差异。(2)Transwell小室体外迁移实验:取生长状态良好的BMSCs细胞培养48h后,消化并收获细胞,用无血清DMEM低糖培养基洗3次,分别接种2.0×105个细胞于已行各组处理因素浸润的Transwell小室中(滤膜微孔直径8μm),行迁移实验。迁移4h后剪下滤膜,用DAPI荧光染液染色,在20倍荧光显微镜下,每孔计数5个视野的细胞数,并取平均值,比较不同处理因素下BMSCs垂直运动能力的差异。取生长状态良好的BMSCs分别进行脂质体转染si NC和si PPP2Ca,前者为对照组,后者沉默PP2A催化亚基PPP2Ca,采用Transwell小室迁移实验,通过与对照组的比较,评价沉默PPP2Ca后BMSCs迁移能力的变化。通过实时定量PCR检测SDF-1刺激后PP2A主要调节亚基的表达变化,探寻SDF-1介导BMSCs迁移过程中可能起作用的功能性调节亚基。结果:(1)Transwell小室迁移实验中,10n M、25n M、50n M三个OA梯度浓度组迁移细胞数均减少,较对照组有统计学差异(p0.05);BMSCs迁移能力与OA浓度呈负相关,OA 10n M组与OA 25n M组迁移到滤膜上的细胞数的差异无统计学意义(p0.05),OA 50n M组与OA 10n M组和OA 25n M组均有差异(p0.05)。SDF-1与OA共刺激组BMSCs的迁移能力较单SDF-1刺激组明显降低(p0.05)(2)划痕实验中,本底水平BMSCs迁移的距离比较,OA作用下BMSCs的划痕愈合距离明显小于对照组,12h时间点OA组与对照组无统计学差异(p0.05),24h、48h时间点较对照组均有差异(p0.05)。验证SDF-1/CXCR4轴的趋化作用,引入SDF-1作为迁移的化学诱导物后,SDF-1和OA共刺激组在12h、24h、48h的划痕愈合距离较SDF-1组均明显减少,有统计学差异(p0.05)。(3)si PPP2Ca转染后,PPP2Ca表达降为对照组的8.88±1.52%(p0.05)。转染si-PPP2Ca的BMSCs迁移能力较对照组明显减弱(p0.05);引入SDF-1刺激后,转染si PPP2Ca的BMSCs的迁移能力与对照组相比,迁移能力有明显减弱(p0.05)。(4)骨髓间充质干细胞经SDF-1刺激后,PP2A调节亚基PPP2R2B表达量上调为209.37±41.03%;(p0.05),STRN3表达量下调为39.58±10.77。结论:1、以PP2A化学抑制剂OA抑制PP2A磷酸酶活性,本底水平及SDF-1诱导下的BMSCs的迁移能力均受到抑制。2、以si RNA方式沉默PP2A催化亚基PPP2Ca,本底水平及SDF-1诱导下的BMSCs的迁移能力均受到抑制。3、PP2A调节亚基B亚群的PPP2R2B和B”’亚群的STRN3的表达受SDF-1的调控。SDF-1可以诱导BMSCs中PPP2R2B高表达,同时BMSCs中STRN3的表达受SDF-1的抑制。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541

【参考文献】

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1 张红珊;方建培;苏浩彬;杨e，

本文编号：1143093