DJ-1通过激活Nrf2信号通路上调抗氧化酶介导心肌细胞缺氧预适应延迟保护

发布时间：2017-11-11 17:40

  本文关键词：DJ-1通过激活Nrf2信号通路上调抗氧化酶介导心肌细胞缺氧预适应延迟保护

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【摘要】：目的:从Nrf2信号通路及其所调控的抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)表达改变的角度探讨DJ-1介导心肌细胞缺氧预适应(HPC)延迟保护的分子机制。方法:1.利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,分别经p Flag-h DJ-1重组载体或对照空质粒p Flag瞬时转染24 h后,建立HPC模型;HPC 24 h后,通过检测以下变化,以求观察DJ-1不同表达水平对HPC预处理H9c2细胞内Nrf2信号通路的影响:①Western Blot检测细胞内DJ-1蛋白表达的变化;②免疫共沉淀(Co-IP)检测Nrf2-Keap1的解离情况;③Western Blot检测Nrf2核转位变化;④染色质免疫共沉淀(Ch IP)法检测胞核内Nrf2与HO-1及Mn SOD基因启动子区内抗氧化反应元件(ARE)结合的变化。2.利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,分别经p Flag-h DJ-1重组载体或对照空质粒p Flag瞬时转染24 h后,建立HPC模型;HPC 24 h后,通过Western Blot检测细胞内抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)蛋白表达的变化,以求观察DJ-1不同表达水平对HPC预处理H9c2细胞内Mn SOD、HO-1蛋白表达的影响。3.利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,分别经p Flag-h DJ-1重组载体或对照空质粒p Flag瞬时转染24 h后,各组细胞分别用Nrf2si RNA或阴性对照si RNA(NC si RNA)转染24 h,随后建立HPC模型;HPC 24h后,通过Western Blot检测细胞内Nrf2及抗氧化酶(Mn SOD、HO-1)蛋白表达的变化,以求观察Nrf2信号通路的抑制对DJ-1所依赖的HPC上调H9c2细胞内Mn SOD、HO-1蛋白表达的影响。4.利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,分别经p Flag-h DJ-1重组载体或对照空质粒p Flag瞬时转染24 h后,各组细胞分别用Nrf2si RNA或阴性NC si RNA转染24 h,随后建立HPC延迟保护模型和缺氧/复氧(H/R)损伤模型,通过检测以下变化,以求观察Nrf2信号通路的抑制对DJ-1所介导的HPC延迟保护的影响:①MTT法检测各实验组心肌细胞存活率的变化;②根据试剂盒说明分别检测各组细胞内LDH活性变化;③应用比色法测定MDA含量;④流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量的变化。结果:1.在H9c2细胞,HPC 24 h后能显著上调DJ-1蛋白表达,同时促进Nrf2与其抑制蛋白Keap1解离,并促进Nrf2入核,增加Nrf2在胞核内与HO-1及Mn SOD基因启动子区内ARE的结合。然而,在DJ-1低表达的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,HPC上述效应被逆转。此外,H9c2/DJ-1 si RNA细胞经p Flag-h DJ-1转染进行回复实验后,DJ-1蛋白表达恢复,同时伴随HPC上述效应的恢复。2.在H9c2细胞,HPC 24 h后能显著上调HO-1及Mn SOD蛋白表达。然而,在DJ-1低表达的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,DJ-1沉默对HPC所诱导的HO-1及Mn SOD蛋白表达上调呈现抑制效应。同样,H9c2/DJ-1 si RNA细胞经p Flag-h DJ-1转染后,HPC上调HO-1及Mn SOD蛋白表达的效应也被恢复。3.H9c2细胞经Nrf2 si RNA处理后产生DJ-1沉默相似效应,对HPC所诱导的HO-1及Mn SOD蛋白表达上调呈现抑制效应。更为重要的是,H9c2/DJ-1si RNA细胞经p Flag-h DJ-1转染后,HPC上调HO-1及Mn SOD蛋白表达的回复效应也被Nrf2 si RNA所逆转。4.在H9c2细胞,HPC 24 h后可显著提高H/R损伤心肌细胞的生存率,抑制LDH的活性;并能显著减少H9c2心肌细胞H/R过程中所产生的活性氧(ROS),同时减少MDA的生成。然而,在DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 si RNA细胞,HPC上述效应被逆转。更为有趣的是,H9c2细胞经Nrf2 si RNA处理后同样产生DJ-1沉默相似效应,对HPC抗H/R所诱发的氧化应激,产生延迟保护作用呈现抑制效应。此外,在H9c2/DJ-1 si RNA细胞,Nrf2 si RNA也逆转DJ-1表达恢复对HPC延迟保护的回复效应。结论:DJ-1介导心肌细胞HPC延迟保护的分子机制与其激活Nrf2信号通路,进而上调Nrf2所调控的抗氧化酶Mn SOD、HO-1的蛋白表达有关。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2

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本文编号：1172433