硝酸甘油对冠心病患者外周血内皮祖细胞体外增殖的影响及机制研究

发布时间：2017-11-18 05:02

  本文关键词：硝酸甘油对冠心病患者外周血内皮祖细胞体外增殖的影响及机制研究

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【摘要】：目的：内皮功能障碍尤其是内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)功能障碍参与动脉粥样硬化的发生发展,研究发现外周血一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度与循环EPCs水平呈明显正相关,提示NO与循环EPCs功能具有密切的联系。鉴于硝酸甘油能通过提供外源性NO来模拟内源性NO释放系统的作用以及NO与EPCs增殖的密切关系,硝酸甘油极有可能促进冠心病患者EPCs的增殖,拥有扩血管作用之外的心血管保护作用,尽管有硝酸甘油过量耐药引起EPCs增殖和功能障碍的报道,但硝酸甘油在临床常用的非耐药情况下对EPCs增殖的影响无疑也具有重要的临床意义,对此目前缺乏系统的研究。此外,硝酸甘油非中毒浓度范围内对EPCs增殖的影响机制、过量耐药产生的机制和对抗耐药的方法等问题,国内外未见有系统的研究报道。本研究体外培养冠心病患者外周血EPCs,观察不同浓度硝酸甘油刺激后,冠心病患者外周血EPCs体外增殖的变化,探索硝酸甘油对EPCs体外增殖的影响及其与药物浓度的关系,在此基础上进行进一步实验,探讨硝酸甘油在典型药物浓度时对EPCs体外增殖影响的相关分子机制以及硝酸甘油耐药的干预措施,以期为硝酸甘油在冠心病治疗中的使用提供新的基础理论依据,探讨其在适宜浓度下成为促EPCs增殖药物的可行性,并为解决硝酸甘油耐药问题提供新的思路。方法：1.取正常健康志愿者的外周血20m1/例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,并将其接种在人纤维连接蛋白包被的6孔细胞培养板中,用加入血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、链霉素、青霉素及胎牛血清的M199培养液培养细胞,7天后收集贴壁细胞,通过细胞形态观察及DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素对贴壁细胞进行双荧光染色鉴定,双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs,并将贴壁细胞重新接种后用MTT法描绘细胞生长曲线。2.经冠状动脉造影等资料确诊为冠心病的患者60例,取外周血20m1/例,培养7天后收集贴壁细胞重新接种,选择采用不同浓度的硝酸甘油0.0 mg/L(对照组)、0.3mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、7.5mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L,对冠心病患者EPCs体外培养进行干预,并用MTT法及人工计数法检测细胞增殖能力,同时检测细胞培养上清液中的NO、人血管内皮生长因子A和过氧化亚硝基阴离子的产生水平,观察硝酸甘油对冠心病患者外周血EPCs的增殖能力的影响。3.观察在硝酸甘油典型药物浓度7.5mg/L及20.0mg/L的基础上联用磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)抑制剂LY294002(在硝酸甘油干预前12小时用LY294002提前干预)对冠心病患者外周血EPCs体外增殖的影响,并检测细胞培养上清液中的NO、人血管内皮生长因子A和贴壁细胞活性氧的产生水平,并用Western blotting检测贴壁细胞的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonone protein kinase,Akt) (Ser473)、磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phospho-serine-threonone protein kinase,P-Akt) (Ser473)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthetase,eNOS) (Ser1177)和磷酸化内皮型一氧化氮合酶(phospho-endothelial nitric oxide synthetase,P-eNOS) (Ser1177)的表达,以初步探索硝酸甘油影响EPCs增殖的机制。4.在硝酸甘油中毒浓度20.0mg/L基础上联用p-巯基乙醇(在硝酸甘油干预前4小时先用p-巯基乙醇干预),复测EPCs增殖能力,活性氧的产生及贴壁细胞Akt (Ser473)、P-Akt (Ser473)、eNOS (Ser1177)和P-eNOS (Ser1177)的表达,探讨β-巯基乙醇对硝酸甘油耐药的影响及其潜在机制。所有实验至少重复4次,计量资料以均数±标准差表示,应用SPSS16.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析比较组间差异,P0.05为差异有统计学意义。结果：1.倒置相差显微镜下细胞形态学特征：培养24小时后单个核细胞开始贴壁,培养7天的EPCs,可见细胞克隆周围出现梭形细胞(图1A)；培养14天的EPCs,可见呈大的集落样生长,四周梭形细胞放射状排列(图1B)；再多培养1-2天呈铺路石样改变(图1C)。用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素鉴定EPCs吸附FITC标记的荆豆凝集素呈绿色(×100)(图1D),EPCs吸附DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白呈红色(×100)(图1E),同时吸附二者呈黄色(x100)(图1F)；外周血EPCs的生长曲线：将分离得到的单个核细胞培养7天后,将贴壁细胞按2×105/ml重悬接种在96孔板中,用MTT检测细胞的增殖能力。可见细胞增殖开始有明显的上升趋势,从第1天到第5天(相当于第8-12天)细胞的吸光度值表现为逐渐增加趋势,尤其到第7天(相当于第14天)的EPCs增殖能力明显增强(图2)。2.本研究发现硝酸甘油在7.5 mg/L促外周血EPCs增殖达峰值,但增加硝酸甘油浓度至20.0mg/L出现明显抑制增殖效应(图3)；培养上清液NO含量随硝酸甘油浓度增加呈现浓度梯度现象(图4)；上清液过氧化亚硝基阴离子含量及贴壁细胞活性氧在硝酸甘油浓度7.5mg/L的范围内增加不明显,浓度20.0mg/L时明显高于对照组(图4和图5)；上清液血管内皮生长因子A含量在硝酸甘油浓度7.5 mg/L时达峰值,之后下降(图4A)；7.5 mg/L硝酸甘油增强EPCs p-eNOS (Ser1177)、p-Akt (Ser473)的表达,20.0mg/L时抑制其表达,上述药物均对eNOS (Ser1177)、Akt (Ser473)的表达无明显作用(图6)。说明硝酸甘油在适量浓度释放适量NO但细胞活性氧(主要是过氧化亚硝基阴离子)产生未过量,此时NO的生物利用度高,提高eNOS、Akt的磷酸化水平,细胞血管内皮生长因子A分泌增加,EPCs增殖活跃,而过高浓度硝酸甘油释放过量NO,细胞活性氧产生过多,NO生物利用度降低,抑制eNOS、Akt的磷酸化,血管内皮生长因子A分泌减少,EPCs增殖能力下降。3.p-巯基乙醇能改善20.0mg/L硝酸甘油对EPCs增殖的抑制作用,降低高浓度硝酸甘油引起的贴壁细胞内活性氧产生,并改善p-eNOS (Ser1177)、p-Akt(Ser473)的表达,但对Akt、eNOS的表达无作用。(见图5,7)结论：1.硝酸甘油对EPCs体外增殖的影响与浓度具有密切的关系,在适宜浓度下对EPCs增殖具有促进作用,过高浓度下其作用趋向抑制。2.适量浓度的硝酸甘油提供的外源性NO通过激活PI3K/Akt信号通路促进血管内皮生长因子A的分泌来促进EPCs增殖作用,高浓度硝酸甘油提供的过量外源性NO使过氧化亚硝基阴离子和活性氧显著增加,损伤细胞酶系统,产生硝酸甘油耐药,抑制p-eNOS,p-Akt表达,使血管内皮生长因子A生成减少,抑制EPCs增殖。3.p-巯基乙醇可通过减轻EPCs的氧化应激和改善PI3K/Akt-eNOS信号通路来逆转硝酸甘油耐药。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4

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本文编号：1198588