miRNA-181a在PDGF-BB诱导血管平滑肌细胞增殖迁移中的机制研究

发布时间：2017-11-22 16:11

  本文关键词：miRNA-181a在PDGF-BB诱导血管平滑肌细胞增殖迁移中的机制研究

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【摘要】：随着生活水平提高,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)、心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)等血管增殖性疾病的发病率逐年升高,已成为严重威胁人类健康的一大杀手,其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的异常增殖和迁移以及新生内膜形成是此类疾病发生的重要病理基础。因此,探究VSMCs增殖迁移的发生机制对于阐明血管增殖性疾病的发病机理具有重要意义。血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,PDGF)是1974年Ross等学者发现的一种来源于血小板且可促进细胞增殖的生长因子,主要有PDGF-AA、PDGF-BB及PDGF-AB三种形式,其中PDGF-BB可与VSMCs表面的PDGF-β受体结合以激活多条信号通路诱导细胞增殖和迁移。microRNA(miRNA)是一类发现于真核细胞中长约20~25个核苷酸的内源性RNA分子,其可参与多种生物学功能,是近几年研究比较成熟的一类非编码RNA,其主要通过碱基互补配对方式结合靶mRNA,导致靶mRNA降解或者阻遏翻译,近几年有一些关于miRNA通过靶基因调控VSMCs增殖迁移的文献报道。研究证实miR-181a可参与肿瘤发生及炎症等过程,且已确定了一些靶基因。我们利用生物信息学软件预测发现PDGFRA、14-3-3γ(YWHAG)、S1PR1及CREBL2等与细胞增殖迁移相关的基因可能为miR-181a新的靶基因,进一步分析发现miR-181a的表达与PDGF-BB诱导的VSMCs增殖呈负相关,提示miR-181a可能参与了PDGF-BB诱导的VSMCs增殖调控过程。因此,本课题拟探究miR-181a调控PDGF-BB诱导VSMCs增殖迁移过程及具体的分子机制。本课题首先以人主动脉VSMCs为研究对象,利用MTT法及实时荧光定量RT-PCR法(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测不同浓度PDGF-BB诱导VSMCs后细胞增殖及miR-181a两种成熟体miR-181a-3p和miR-181a-5p的表达;以慢病毒为载体过表达或抑制miR-181a并构建稳转VSMCs细胞系,探究miR-181a对PDGF-BB诱导VSMCs增殖及迁移的影响;利用生物信息学及双荧光素酶报告基因法预测并验证miR-181a靶基因;构建大鼠颈动脉球囊损伤模型,过表达或抑制mi R-181a慢病毒局部感染以探究miR-181a对新生内膜形成的影响。实验结果如下:1.不同浓度PDGF-BB(0、1、5、10、20 ng/mL)诱导VSMCs后,细胞增殖随PDGF-BB升高而逐渐增强;mi R-181a-3p及miR-181a-5p表达随PDGF-BB浓度升高而逐渐下降,表明miR-181a可参与VSMCs增殖调控过程;miR-181a-3p占miR-181a-5p表达量约5~10%,表明主要为miR-181a-5p成熟体形式存在并发挥作用。2.利用慢病毒载体,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100感染人主动脉VSMCs,2μg/mL嘌呤霉素筛选后建立阴性对照(NC)、miR-181a-1 up(LV-miR-181a)和miR-181a-5p-inhibition(Anti-miR-181a-5p)稳转VSMCs细胞系;与NC组VSMCs相比,LV-miR-181a中miR-181a-5p表达上调约12倍,说明稳转VSMCs细胞系构建成功。MTT法、EdU法分析过表达miR-181a-1可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖,抑制miR-181a-5p可显著促进VSMCs增殖;增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)蛋白水平测定呈现相同趋势。细胞划痕损伤法、Transwell小室法检测过表达miR-181a-1可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs迁移,而抑制miR-181a-5p可促进VSMCs的迁移。表明miR-181a-5p可抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖和迁移。3.利用Targetscan等生物信息学软件预测miR-181a-5p与细胞增殖迁移相关的潜在靶基因,发现PDGFRA、14-3-3γ、S1PR1及CREBL2可能为miR-181a-5p靶向调控的基因;构建荧光素酶-靶基因3’-UTR及突变体真核表达载体,与miR-181a-5p mimics/inhibitors共转293细胞后检测荧光素酶活性,14-3-3γ及S1PR1报告基因质粒荧光素酶活性均显著降低,表明14-3-3γ及S1PR1为miR-181a-5p的靶基因。Western Blotting分析不同浓度PDGF-BB诱导VSMCs细胞14-3-3γ及S1PR1蛋白水平,结果显示在一定浓度范围内两种蛋白表达随PDGF-BB浓度增加而增多,过表达miR-181a-5p VSMCs可显著降低14-3-3γ及S1PR1蛋白水平。4.球囊拉伤法建立Sprague Dawley(SD)雄性大鼠颈动脉新生内膜形成模型,qRT-PCR检测发现与假手术(Sham)组相比,模型(Model)组大鼠颈总动脉组织中miR-181a-5p表达量下调约80%,暗示miR-181a-5p参与新生内膜形成过程;颈动脉局部感染LV-miR-181a慢病毒后miR-181a-5p表达量上调约4.5倍,病理形态学观察过表达miR-181a后内膜/中膜面积比值(I/M)相比NC组下降约40%,而抑制miR-181a-5p后I/M升高约30%,表明miR-181a-5p可抑制新生内膜形成;Western Blotting检测Model组中14-3-3γ蛋白表达相比Sham组上调约4.5倍,过表达miR-181a后14-3-3γ蛋白表达量下调约35%。上述结果表明,miR-181a-5p通过靶向14-3-3γ基因抑制PDGF-BB诱导VSMCs的增殖迁移和颈动脉损伤新生内膜的形成,对于阐明血管增殖性疾病的发病机理具有重要意义。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
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本文编号：1215276