超声靶向破坏微泡增强microRNA-21转染猪心肌组织的研究

发布时间：2017-11-24 16:24

  本文关键词：超声靶向破坏微泡增强microRNA-21转染猪心肌组织的研究

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【摘要】：目的超声靶向破坏微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)作为一项高效、安全、具有靶向性的非病毒基因传输技术,已成功应用于体外及小动物研究。然而,UTMD介导外源基因转染大动物心肌组织的可行性、转染条件及其效果如何,目前国内外少有研究报道。本研究拟探讨UTMD介导microRNA-21 (miR-21)转染猪心肌的可行性并进一步优化其转染参数。方法构建miR-21真核表达质粒并体外转染血管内皮细胞以检测其表达活性。我们首先优化UTMD介导miR-21转染猪心肌组织的适宜辐照强度。经耳缘静脉给予载基因超声微泡(miR-21/MB),同时以不同超声强度(1W/cm2,2W/cm2,3W/cm2)辐照左室前壁直至微泡消失。待研究得出适宜辐照强度后进一步探讨UTMD介导miR-21经静脉与冠脉转染猪心肌组织的效果。分别经耳缘静脉及冠脉左前降支(LAD)给予miR-21/MB,同时经胸进行超声辐照；以单纯PBS注射组(空白对照组)、单纯静脉或冠脉注射miR-21/MB而不予超声辐照组作为对照。采用心脏超声评价心功能,以电化学发光法(ELC)检测血清肌钙蛋白I (cTnI)水平；术后4天取左室前壁心肌组织,冰冻切片荧光显微镜下观察心肌组织增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,石蜡切片HE染色观察心肌组织形态学改变,分别采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织miR-21及其靶基因PDCD4的表达水平。结果miR-21重组质粒构建成功并可在真核细胞内有效表达。应用心脏超声在术前及术后不同时间点(3h,12h,24h,4d)检测心功能,结果发现不同强度超声辐照(1 W/cm2,2W/cm2,3W/cm2)各组心功能指标(LVEF,FS, CO及LVEDd)均未见明显动态改变,差异无统计学意义(P0.05)。血清cTnI动态检测结果显示,3W/cm2超声辐照组血清cTnI水平呈动态改变,术后3h开始升高,12h达高峰,此后逐渐下降并于术后4d回到基线水平(P0.05)。1W/cm2及2W/cm2超声辐照组术后不同时间点血清cTnI水平均未见明显改变,差异无统计学意义(P0.05)。HE染色结果显示不同强度超声辐照各组心肌组织形态保持完好,未见心肌坏死、出血以及炎症反应等。FQ-PCR结果表明与1W/cm2、3W/cm2超声辐照组相比,2W/cm2超声辐照心肌组织miR-21表达水平较高(P0.05)。Western blot结果显示与1W/cm2超声辐照组相比,2 W/cm2、3W/cm2超声辐照均可显著抑制心肌组织PDCD4表达,尤以2W/cm2超声辐照组明显(P0.05)。UTMD介导miR-21经静脉与冠脉转染猪心肌,冰冻切片荧光显微镜下观察发现空白对照组心肌组织未见EGFP表达；单纯静脉或冠脉给予miR-21/MB, EGFP表达主要位于心内膜下及血管周围；联合超声辐照后,心肌组织可见明显EGFP表达。FQ-PCR结果显示与空白对照组相比,单纯静脉给予miR-21/MB并不能提高心肌组织miR-21表达(P0.05),单纯冠脉给予miR-21/MB虽可提高心肌组织miR-21表达,但转染效率仍然较低(P0.05)。与单纯给予miR-21/MB相比,不论静脉抑或冠脉内给药,UTMD均可显著提高心肌组织miR-21表达(P0.05),其中冠脉给药组稍高于静脉给药组,尽管其给药剂量为静脉组的一半(P0.05)。Western blot结果表明,单纯静脉给予miR-21/MB不能抑制PDCD4表达(P0.05)；单纯冠脉给予miR-21/MB,心肌组织PDCD4表达稍有下降(P0.05)；而UTMD介导miR-21经静脉或冠脉转染猪心肌可显著抑制PDCD4表达(P0.05),尤以冠脉给药组明显(P0.05)。结论以强度2W/cm2,频率1MHz,占空比50%,脉冲辐照20min,不论经静脉抑或冠脉途径给药,UTMD均可显著增强外源基因转染大动物心肌组织。考虑到临床应用的简便性、较小的侵入性以及较低的技术要求,静脉内给药可能是更好的选择。然而对于拟行经皮冠脉介入治疗的患者,冠脉内给药不失为另一种选择。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2

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本文编号：1222887