CD47在骨髓增生异常综合征发病机制中作用的研究

发布时间：2017-11-24 17:20

  本文关键词：CD47在骨髓增生异常综合征发病机制中作用的研究

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【摘要】：目的骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndromes,MDS)是一种异质性疾病,是造血干细胞的恶性克隆性疾病。本研究以MDS患者为研究对象,在细胞和个体层次分析CD47在MDS发病机制的作用。分析分选后CD34+CD38-CD47+细胞中细胞核因子kB(NF-kB)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)等关键调节蛋白及磷酸化表达;分选后MDS患者CD34+CD38-CD47+细胞被巨噬细胞吞噬指数分析。本文初步探讨了CD47在MDS发病机制中发挥的作用,进而可以为将来骨髓增生异常综合征的靶向调节和治疗奠定基础。方法第一部分收集21例MDS患者为实验组(MDS组),20例非恶性贫血患者为对照组。流式细胞仪分选CD34+CD38-CD47+细胞,实时定量PCR(qPCR)法检测CD34+CD38-CD47+细胞NF-kB、PI3K、AKT、PTEN、mTOR mRNA表达。第二部分收集10例MDS患者为实验组(MDS组),8例急性髓系白血病(AML)患者为阳性对照组,11例非恶性贫血患者为阴性对照组。流式细胞术检测CD34+CD38-CD47+细胞pNF-kB、pAKT、pmTOR蛋白的表达。第三部分收集5例MDS患者为实验组(MDS组),4例非恶性贫血患者为对照组,将MDS患者/对照组患者的骨髓单个核细胞分别与正常人来源的巨噬细胞共培养,使用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)分别标记MDS患者/对照组患者的骨髓单个核细胞,在荧光显微镜下观察测定并比较两群细胞的被吞噬指数。第四部分外周血单个核细胞转化巨噬细胞实验○1使用流式细胞术和光学显微镜研究MDS患者外周血单个核细胞转化巨噬细胞的比率,收集8例MDS患者为实验组(MDS组),5例健康志愿者为对照组;○2研究MDS患者来源的巨噬细胞识别功能(甘露糖受体,cd206),并与正常人来源的巨噬细胞相比较。收集10例mds患者为实验组(mds组),9例健康志愿者为对照组;采用流式细胞术分析7例mds患者(实验组)和11例健康志愿者(对照组)来源的巨噬细胞上的表面受体信号调节蛋白a链(sirpa)的表达;○3采用荧光显微镜法和流式细胞术法分别观察mds患者/正常人来源的巨噬细胞的吞噬功能。收集5例mds患者为实验组(mds组),4例健康志愿者为对照组;○4用酶联免疫吸附法(elisa)检测18例mds患者来源巨噬细胞培养上清inos水平,并与8例健康志愿者作为正常对照,比较mds患者来源调节巨噬细胞杀伤功能的负调控因子的表达。结果第一部分qpcr法检测到mds组(n=21)cd34+cd38-cd47+细胞nf-kb、pi3k和mtormrna表达水平(分别为19.67±2.47、36.44±13.21和10.61±1.47)显著高于对照组(n=20,分别为1.40±0.25、1.63±0.42和2.45±0.83,p0.05);mds组cd34+cd38-cd47+细胞akt和ptenmrna表达水平(分别为4.63±1.63和1.94±0.33)高于对照组(分别为1.39±0.24和1.48±0.27),但是没有统计学差异,p0.05。第二部分流式细胞术法检测到mds组(n=10)cd34+cd38-cd47+细胞pnf-kb蛋白的平均荧光强度(1.18±0.15)显著高于阴性对照组(n=11,0.80±0.07,p0.05),低于aml组(n=8,1.72±0.49),但是没有统计学差异,p0.05;mds组cd34+cd38-cd47+细胞pakt蛋白的平均荧光强度(1.15±0.11)高于阴性对照组(1.01±0.12),低于aml组(1.89±0.68),但是均没有统计学差异,p0.05;mds组cd34+cd38-cd47+细胞pmtor蛋白的平均荧光强度(1.09±0.04)显著高于阴性对照组(0.94±0.04,p0.05),低于aml组(1.89±0.68),但是没有统计学差异,p0.05。第三部分通过cfse染色分别标记mds患者/对照组患者的骨髓单个核细胞,在荧光显微镜下观察到mds组(n=5)的被吞噬指数(16.40±1.67)显著低于对照组(n=4,47.75±9.56,p0.05)。第四部分○1流式细胞术检测MDS组(n=8)外周血单核细胞转化为巨噬细胞的转化率为(5.17±3.47)%,显著低于正常对照组(66.18±13.43%,P0.05),光学显微镜下MDS组转化为的巨噬细胞较正常对照组的形态较差;○2流式细胞术检测到MDS组(n=10)巨噬细胞的识别受体CD14+CD68+CD206+的表达水平(9.73±2.59)显著低于正常对照组(n=9,51.15±10.82,P0.05);MDS组(n=7)巨噬细胞表面受体CD14+CD68+SIRPα+的表达水平(0.51±0.09)显著低于正常对照组(n=11,0.77±0.06,P0.05);○3流式细胞术检测到MDS组(n=5)来源的巨噬细胞吞噬免疫微球的吞噬指数及吞噬百分率(分别为0.45±0.08、23.69%±3.22%)显著低于正常对照组(n=4,分别为0.92±0.07、42.75%±2.13%,均P0.05);在荧光显微镜下观察到MDS组(n=5)来源的巨噬细胞吞噬单个核细胞的吞噬指数(0.24±0.04)显著低于正常对照组(n=4,0.48±0.96,P0.05);○4 MDS患者来源巨噬细胞培养上清iNOS水平(35.30±7.06)高于正常对照组(22.05±3.67),但是没有统计学差异,P0.05。结论MDS患者CD34+CD38-CD47+细胞中的PI3K信号通路较对照组是激活的;MDS患者骨髓单个核细胞较对照组能够明显抑制巨噬细胞的吞噬;MDS患者来源的巨噬细胞识别及吞噬、杀伤功能较对照组明显下降。本研究推测MDS患者骨髓单个核细胞通过抑制巨噬细胞的吞噬作用进而促进疾病的进展,并且MDS患者的巨噬细胞功能下降可能是促进MDS的疾病进展的原因之一。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R551.3

【参考文献】

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1 王建祥;;白血病干细胞的研究现状[J];中华血液学杂志;2011年06期

2 程千松;王兴兵;;CD47与白血病干细胞[J];中国实验血液学杂志;2010年04期

3 邵宗鸿;岳兰竹;;骨髓增生异常综合征领域的疑惑与思考[J];中华医学杂志;2013年40期

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本文编号：1223020