丹蒌片对雷帕霉素诱导的人主动脉内皮细胞凋亡的保护机制研究
本文关键词：丹蒌片对雷帕霉素诱导的人主动脉内皮细胞凋亡的保护机制研究
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【摘要】：目的探讨丹蒌片对雷帕霉素诱导的人主动脉内皮细胞凋亡的影响,并试探明其可能的机制。方法1.用不同剂量的雷帕霉素,依次作用在HAECs上,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)测定HAECs细胞的增殖抑制率;通过计算细胞增殖抑制率、绘制增殖抑制曲线等,综合分析雷帕霉素对HAECs增殖活性的影响。2.通过不同浓度的含药兔血清与雷帕霉素共同作用于HAECs,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)测定HAEC细胞的抑制率变化,摸索出适宜的含药血清浓度进行下一步实验。3.运用流式细胞术检测细胞凋亡率,观察含药血清对雷帕霉素作用下细胞凋亡率的变化。4.采用实时荧光定量PCR技术及蛋白免疫印迹技术检测对细胞内的相关凋亡(Caspase-3,Bax,Bcl-2)基因及蛋白表达的影响,运用蛋白免疫印迹技术检测PI3K/Akt通路中p-Akt蛋白表达的变化。结果1.雷帕霉素对HAECs有明显的抑制细胞生长的作用,与阴性对照组的比较,差异有统计学意义(P㩳0.05),并且成剂量和时间依赖性。2.各组用不同浓度含药血清处理后,在12h、24h、48h时间点,含5%、15%、20%浓度空白兔血清的雷帕霉素组与相对应空白组相比,细胞存活率降低,且有统计学意义(p0.05),5%、15%浓度丹蒌片组与雷帕霉素组相比,细胞存活率上升,且有统计学差异(P0.05),但与可定组细胞存活率无统计学差异(P0.05),5%、15%混合组与可定组和丹蒌片组相比细胞存活率升高,且均有统计学差异(P0.05)。15%浓度含药血清作用下各组细胞存活率最高,含药血清浓度与细胞存活率之间不存在剂量依赖性。3.各组选用1ng/ml浓度雷帕霉素作用下,15%含药血清浓度处理细胞24h,流式细胞仪检测凋亡率,丹蒌片组较雷帕霉素组凋亡率降低(18.23±1.36vs23.23±0.76,P0.05),丹蒌片组与可定组之间无明显差别(P0.05),混合组与丹蒌片、可定组相比,凋亡率降低(14.87±0.61vs18.23±1.36,P0.05;14.87±0.61vs17.48±0.66,P0.05)。4.荧光定量PCR检测1ng/ml浓度雷帕霉素作用下15%含药血清浓度处理细胞24h后相关凋亡基因表达,丹蒌片组与雷帕霉素组相比Bax(4.46±0.45vs5.24±0.56)、Caspase-3(2.37±0.25vs3.96±0.22)表达量减少(P0.05),Bcl-2表达量增加(0.58±0.06vs0.47±0.08,P0.05),丹蒌片组与可定组之间Bax、Bcl-2、Caspase-3表达量均无统计学差异(P0.05);混合组与丹蒌片相比Bax(2.88±0.47vs4.46±0.45,P0.05)、Caspase-3(1.63±0.28vs2.37±0.25,P0.05)表达量降低,Bcl-2表达量增加(0.83±0.08vs0.58±0.06,P0.05)。5.Western-blot检测1ng/ml浓度雷帕霉素作用下15%含药血清浓度处理细胞24h后相关凋亡蛋白表达及p-Akt蛋白表达,丹蒌片组与雷帕霉素组相比Bax(63.26±5.06vs77.92±5.28)、Caspase-3(112.24±4.81vs147.14±7.94)表达量减少(P0.05),Bcl-2表达量增加(34.13±13.23vs11.66±10.40,P0.05),丹蒌片组与可定组之间Bax、Bcl-2、Caspase-3表达量均无统计学差异(P0.05)。混合组与丹蒌片组相比Bax(31.76±5.75vs63.26±5.06)、Caspase-3(76.25±3.88vs112.24±4.81)表达量减少(P0.05),Bcl-2表达量增加(63.32±11.68vs34.13±13.23,P0.05)。丹蒌片组与雷帕霉素组相比,p-Akt表达量减少(134.56±20.21vs97.90±15.71,P0.05),混合组与丹蒌片组相比p-Akt表达量减少(58.83±6.09vs97.90±15.71,P0.05),丹蒌片组与可定组相比无明显差异(97.90±15.71vs83.15±9.99,P0.05)。结论1.雷帕霉素对HAECs有促凋亡作用,且成剂量及时间依赖性,剂量越大,作用时间越长,对细胞抑制率越大。2.丹蒌片能抑制雷帕霉素诱导的HAECs凋亡,在雷帕霉素为1ng/ml时,15%浓度含药血清抑制凋亡效果最佳。3.丹蒌片能上调抗凋亡基因Bcl-2表达,下调促凋亡基因Bax、caspase-3表达量,抑制雷帕霉素诱导的HAECs凋亡。4.丹蒌片可能通过调节p-Akt的表达,调控抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax、caspase-3表达。
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
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本文编号：1241391
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