白藜芦醇通过上调SIRT1增加自噬流并促进氧化低密度脂蛋白在人脐静脉内皮细胞中的降解

发布时间：2017-12-01 23:11

  本文关键词：白藜芦醇通过上调SIRT1增加自噬流并促进氧化低密度脂蛋白在人脐静脉内皮细胞中的降解

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【摘要】：目的:氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的自噬障碍参与了动脉粥样硬化(AS)的发生发展。白藜芦醇(RSV)对Ox-LDL引起的HUVECs损伤有保护作用。本研究旨在探讨Ox-LDL引起HUVECs自噬障碍的具体机制,并探讨RSV保护HUVECs的作用是否与其调控自噬流有关。方法:以HUVECs为研究动脉粥样硬化的工具细胞;以Ox-LDL及SIRT1激动剂RSV为工具药;使用不同浓度及时间点的Ox-LDL及RSV处理HUVECs,采用CCK8检测Ox-LDL及RSV对HUVECs活力的影响;采用western blot检测HUVECs中SIRT1、LC3-II/LC3-I、p62的蛋白表达水平;采用反转录PCR(RT-PCR)检测Ox-LDL对HUVECs内p62的转录水平的影响;采用流式细胞仪及激光共聚焦方法检测Dil-Ox-LDL在HUVECs中的聚集变化及RSV对HUVECs中Dil-Ox-LDL聚集的影响;采用瞬时转染技术构建SIRT1基因敲减及GFP-RFP-LC3基因过表达细胞模型;采用激光共聚焦方法检测细胞中自噬流的改变;采用western blot方法检测溶酶体膜蛋白LAMP1及溶酶体酶cathepsin D蛋白表达水平;采用cathepsin D活性试剂盒检测cathepsin D活性。结果:1.Ox-LDL能剂量(0、30、60、90、120μg/ml)、时间(0、0.5、1、3、6、12、24 h)依赖性增加HUVECs中LC3II、p62蛋白的表达,减少SIRT1蛋白表达;CCK8结果示Ox-LDL能剂量依赖性降低HUVECs活性(90μg/ml、120μg/ml有统计学意义);RT-PCR结果示Ox-LDL对HUVECs的p62转录水平无明显影响;在使用巴弗洛霉素(BAF-1)完全阻断自噬流情况下,Ox-LDL不能增加LC3II的蛋白水平。2.0-50μM的RSV对HUVECs活性无损伤。RSV能剂量(0、12.5、25、50μM)及时间(0、0.5、1、3、6、12 h)依赖性增加HUVECs中SIRT1、LC3II并减少p62的蛋白水平,。3.50μM RSV能增加被Ox-LDL减少的SIRT1蛋白水平、减少被Ox-LDL增加的p62蛋白水平,并能进一步增加LC3II的蛋白水平;激光共聚焦及流式细胞仪结果示RSV能显著减少HUVECs内Dil-Ox-LDL的聚集;但RSV并未减少HUVECs膜上被Ox-LDL诱导增加的植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)蛋白表达。4.激光共聚焦结果示Ox-LDL能增加转染过GFP-RFP-LC3的HUVECs中的GFP-LC3、RFP-LC3的共定位,RSV能显著减少HUVECs中被Ox-LDL引起的GFP-RFP-LC3共定位并进一步增加RFP-LC3的点状分布;Ox-LDL未改变HUVECs中溶酶体膜蛋白LAMP1的蛋白表达;RSV能增加被Ox-LDL减少的HUVECs中溶酶体酶cathepsin D的成熟片段的蛋白表达;cathepsin D活性试剂盒结果进一步提示RSV能增加被Ox-LDL降低的HUVECs中cathepinsin D的活性;在使用巴弗洛霉素A1(抑制自噬体和溶酶体融合)后,RSV不能减少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。5.在敲减HUVECs中的SIRT1基因后,RSV对Ox-LDL引起的HUVECs中的SIRT1、LC3II、p62、cathepisin D蛋白水平改变的保护作用消失、同时不能增加被Ox-LDL降低的cathepsin D的酶活性,并且不能减少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。结论:白藜芦醇通过上调HUVECs中SIRT1的表达,可以增加溶酶体中cathepsin D的蛋白水平及cathepsin D酶活性而修复被Ox-LDL损伤的溶酶体功能,从而提高HUVECs中被Ox-LDL损伤的自噬流,进一步促进Ox-LDL在HUVECs中通过自噬溶酶体途径的降解。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

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本文编号：1242784